Thảo luận XÉT NGHIỆM VIRUS ZIKA BẰNG KỸ THUẬT PCR

XÉT NGHIỆM VIRUS ZIKA BẰNG KỸ THUẬT PCR​

​

I. NGUYÊN LÝ
Quy trình xét nghiệm vi rút ZIKA dựa trên xét nghiệm phát hiện vật liệu di truyền bằng phương pháp sinh học phân tử, phương pháp này có thể là phản ứng chuỗi polymerase (PCR) hoặc phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực (realtime PCR). Hiện nay, kỹ thuật Realtime RT- PCR hay RT- PCR đã trở thành một công cụ được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực của y sinh học đặc biệt là lĩnh vực chẩn đoán bệnh với các tác nhân là vi rút.
❖ Kỹ thuật RT- PCR
- RNA tổng số được tách từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng nghi nhiễm ZIKA. Sau đó, RNA được cho vào hỗn hợp RT-PCR với các cặp mồ i đặc hiệu cho vi rút ZIKA. RNA có thể được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng (máu, huyết thanh...) hoặc từ dịch nổi nuôi cấy tế bào.
❖ Kỹ thuật realtime RT- PCR
- Quy trình xét nghiệm vi rút ZIKA dựa trên xét nghiệm phát hiện vật liệu di truyền bằng phương pháp sinh học ph n tử, phương pháp này là phản ứng chuỗi polymerase thời gian th c (realtime PCR). Hiện nay, k thu t Realtime RT- PCR đã trở thành một công c được ứng d ng rộng rãi trong các l nh v c của y sinh học đặc biệt là lĩnh vực chẩn đoán bệnh với các tác nhân là vi rút. Phương pháp này sử dụng thêm bộ mẫu dò phát huỳnh quang (probe) có khả năng phát hiện sản phẩm (vật liệu di truyền của vi rút) trong quá trình tổng hợp sản phẩm. Mẫu dò là một đoạn oliognucleotit (vd: Taqman® probe) được gắn với một chất nhuộm phát tín hiệu huỳnh quang ở đầu 5’ ®, đầu kia th được gắn với thuốc nhuộm d p tắt huỳnh quang (Q). Khi mẫu d c n nguyên vẹn, Q có vai trò nhận năng lượng phát ra từ R (hiệu ứng chuyển năng lượng huỳnh quang). Nếu có trình tự đích, mẫu dò và mồ i sẽ gắn vào khuôn, quá trình tổng hợp bắt đầu. Trong quá trình tổng hợp, enzym Taq DNA polymerase với hoạt tính exonuclease sẽ cắt các nucleotid của mẫu dò từ đầu 5’, giải phóng R khỏ i Q, làm tăng tín hiệu huỳnh quang của R. Càng nhiều sản phẩm tạo thành th càng nhiều mẫu d bị phân cắt và tín hiệu của R phát ra càng nhiều. Mắt đọc tín hiệu huỳnh quang của máy sẽ thu tín hiệu R, xử lý bằng phần mềm và đưa ra kết quả cuối cùng.

II. CHỈ ĐỊNH
Các trường hợp nghi ngờ nhiễm virus ZIKA.

III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.

IV. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Kỹ thuật viên xét nghiệm đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;
- Trưởng khoa hoặc người được ủy quyền duyệt kết quả.

2. Phương tiện - Hóa chất
2.1. Điều kiện bảo quản
2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm
- Hóa chất sinh phẩm sử dụng trong phản ứng sinh hoc phân tử phải được bảo quản theo khuyến cáo của nhà sản xuất để đảm bảo tính ổn định của hóa chất/sinh phẩm.
- Khi sử dụng sinh phẩm cho pha chế, phải luôn được giữ lạnh và cất lại ngay sau khi dùng xong.
2.1.2.Dụng cụ tiêu hao và trang thiết bị
- Dụng cụ tiêu hao trong phòng thí nghiệm được bảo quản luôn thông thoáng. Khi sử dụng sẽ được ghi chép thông tin trong biểu mẫu phiếu theo dõi vật tư.
- Trang thiết bị trong phò ng thí nghiệm được bảo quản và vận hành trong khoảng nhiệt độ từ 25±5oC, độ ẩm từ 45-90%.
2.2. Hóa chất và sinh phẩm
2.2.1. Hóa chất
- Cồn tuyệt đối;
- Dung dịch đệm TBE x10;
- Thạch điện di.
2.2.2.Sinh phẩm
- QIAGEN Onestep RT-PCR: sinh phẩm dùng trong phản ứng RT-PCR + Đệm PCR 5X (RT-PCR Bufer, 5x).
+ dNTP: gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP, ở nồng độ 10mM.
+ Enzym Mix (Omniscript TM, Sensiscript TM và HotStarTaq DNA polymeraza).
+ Nước cất tinh sạch (RNase-Free Water).
- QuantiTect Probe RT-PCR kit - Qiagen: Sinh phẩm dung cho phản ứng Realtime RT-PCR.
+ 2x QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix.
+ QuantiTect RT Mix 0.5 ul.
+ Nước cất tinh sạch (RNase-Free Water).
- Bộ mồi cho phản ứng RT-PCR

​

- Bộ mồi cho phản ứng real-time RT-PCR
Trình tự các cặp mồi và probe cho ZIKA

​

2.2.3. Chứng chuân:
- Chứng dương (Positive control - POS): ZIKA
- Chứng âm (No Template Control - NTC): sử dụng nước cất để kiểm tra qúa trình pha sinh phẩm hóa chất
- Chứng âm tách chiết (Negative Extraction Control - NEC): sử dụng nước cất để kiểm tra quá trình tách chiết
2.3. Dụng cụ tiêu hao và trang thiết bị
2.3.1. Dụng cụ tiêu hao
- Dụng cụ cho lấy mẫu
+ Túi/hộp để đóng gói bệnh phẩm;
+ Băng, gạc có tẩm chất sát trùng;
+ Trang phục bảo hộ (găng tay, khẩu trang...);
+ Bình lạnh bảo quản mẫu;
+ Bơm tiêm 5 ml, vô trùng;
+ Tube lấy máu (không có chất chống đông);
+ Dây garo, bông, c ồ n bút ghi ... ;
+ Tube bảo quản mẫu ở -20oC;
+ Hộp giấy đựng mẫu ở -20oC.
- Dụng cụ cho xét nghiệm
+ Tube ly tâm 1.5 ml vô trùng;
+ Tube ly tâm 2.0 ml vô trùng;
+ Pippetman: 10; 20; 100; 200 và 1000 |l;
+ Đầu côn lọc: 10; 30; 100; 200 và 1000 |l;
+ Tube tiệt trùng: 0.2; 0.5 và 1.7 ml;
+ Giá tích lạnh;
+ Tube 0,2 ml có nắp dành cho realtime RTPCR;
+ Khay chạy điện di 100-250 ml và lược;
+ Lò vi sóng 850-1300 W;
+ Cốc đong 100-300 ml;
+ Đ a microtitre hoặc giấy parafilm;
+ Bể nhuộm gel (nếu cần thiết).
3.2.2. Trang thiết bị
- Pipet;
- Máy lắc;
- Lò sấy;
- Cân điện tử;
- Máy luân nhiệt;
- Bể điện di;
- Máy chụp Gel;
- Máy ly tâm;
- Tủ an toàn;
- Tủ lạnh.

3. Mẫu bệnh phẩm
- Loại mẫu: huyết thanh, máu toàn phần, dịch tiết....
- Điều kiện bảo quản: bảo quản lạnh.
- Bảo quản tại nơi lấy mẫu: bảo quản bệnh phẩm tại nơi lấy mẫu từ 2°C- 8°C,trong vòng 3 ngày mẫu sẽ được chuyển tới PTN, trong quá trình vân chuyển đến PTN giữ tại 2°C- 8°C

I. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1. Tách chiết mẫu

1. Kiểm tra độ đồng nhất 560 |l đệm AVL có chứa chất mang ARN trong tube 2 ml.
2. Thêm 140 |l mẫu vào 560 |l dung dịch ly giải virut AVL có chất mang ARN.
3. Trộn bằng máy trộn khoảng 15 gi ây, để tạo một hỗn dịch đồ ng nhất giữa mẫu và đệm AVL, ủ ở nhiệt độ phò ng 10 phút đảm bảo các hạt virut bị ly giải hoàn toàn, ARN của virut bị ly giải được gắn vào chất mang ARN.
4. Ly tâm nhanh tube hỗn hợp khoảng 10 gi ây bằng máy ly t âm MICROFUGE để tất cả các dung dịch không dính trên nắp tube. Thêm 560|l Ethanol (96-100%) vào mỗi tube, trộn đều bằng máy trộn trong 15 giây, Ethanol sẽ tủa các sợi ARN.
5. Ly tâm nhanh khoảng 10 gi ây.
6. Cho 630 |l hỗn dịch trên vào cột QIAamp, ly tâm 8.000 vò ng trong 1 phút.
Tất cả ARN sẽ được gắn trên bề mặt màng Silicagel với sự có mặt của chất mang ARN. Chuyển cột sang tube 2ml mới.
7. Mở nắp cột QIAamp, lặp lại bước 6.
8. Mở nắp cột QIAamp, thêm 500|l đệm AW1. Đóng nắp và ly tâm 8.000 vòng trong 1 phút. Chuyển cột spin sang tube 2ml sạch và loại bỏ tube có chứa dịch lọc. AW 1 có tác dụng loại bỏ các thành phần không phải là ARN có trên mặt màng Silicagel.
9. Mở nắp cột QIAamp, thêm 500|l đệm AW2. Đóng nắp và ly tâm trong khoảng từ 12.000 vò ng đến 14.000 vò ng trong 3 phút. Chuyển cột QIAamp sang tube2ml sạch và loại bỏ tube có chứa dịch lọc. Và ly tâm thêm 1 phút ở tốc độ từ 12.000 vòng đến 14.000 vòng để loại bỏ hoàn toàn đệm AW2.
10. Chuyển cột spin QIAamp vào tube ly t âm sạch 1.5ml và loại b ỏ tube chứa dịch lọc cũ.
11. Mở nắp cột spin QIAamp, thêm 60 |l đệm A VE và ủ ở nhiệt độ phò ng trong 1 phút. Ly tâm 8.000 vòng trong 1 phút để toàn bộ ARN tách khỏi màng Silicagel. Sau khi ly tâm toàn bộ ARN của mẫu sẽ được thu hồ i trong dịch lọc.
12. Lưu giữ ở -20oC hoặc -80oC trong thời gian 6 -12 tháng.

2. Pha chế hóa chất/sinh phẩm
- Mã hóa loạt pha chế

​

3. Pha thạch điện di
- Số lượng thành phần Agarose được chuẩn bị:

​

- Cách đổ thạch:
+ Đổ thạch bằng khay điện di có cài sẵn răng lược.
+ Lượng Agarose và TBE phụ thuộc vào nồ ng độ thạch và số lượng khuôn thạch cần chuẩn bị được tính theo bảng trên.
Ví dụ: Chuẩn bị 100 ml thạch 2,5%: cần 2,5 g Agarose bột và 100ml TBE.
Cho Agarose bột và dung dịch TBE vào cốc thuỷ tinh. Làm tan Agarose bằng l ò vi sóng trong khoảng 3-4 phút, đảm bảo Agarose tan hoàn toàn.
+ Để nguội khoảng 50-60oC rồ i cho 10 gl Ethidium bromide lắc đều, đổ dung dịch Agarose này vào khuôn điện di có cài sẵn răng lược. Sau khoảng 60 phút ở nhiệt độ phòng, khi gel đã đông, gỡ nhẹ nhàng răng lược ra. Bảo quản gel ở 4oC.
- Đặt tên cho loạt pha.

4. Pha cặp mồi cho phản ứng
- Nồng độ mồi tính theo đơn vị nmole (ghi trên tube mồi đông khô).
- Trả lại nước khử ion theo khuyến cáo của nhà sản xuất để đạt nồng độ gốc.
- Nồng độ mồi sử dụng được pha từ nồng độ gốc.
- Chia ra các tube có thể tích từ 50 - 200 pl /1 loại mồi/mẫu dò và bảo quản tại -30oC.
- Đặt tên cho loạt pha

5. Pha sinh phẩm cho phản ứng RT-PCR
Thành phần pha sinh phẩm cho phản ứng RT-PCR.

​

- Đặt tên cho loạt pha

6. Pha sinh phẩm cho phản ứng Realtime-RT-PCR

Thành phần pha sinh phẩm cho phản ứng Realtime RT-PCR

​

- Đặt tên cho loạt pha

7. Quy trình RT-PCR

Cài đặt thiết bị
- Cài đặt thiết bị cho máy PCR
Chu trình nhiệt cho ZIKA nhóm chung:

​

​

Tra mẫu và chạy máy
- Cho 5 ul mẫu RNA bệnh phẩm vào hỗn hợp sinh phẩm đã chuẩn bị cho phản ứng RT-PCR. Mâu chứng dương: được thực hiện tại tủ an toàn mâu.
- Đặt các tube vào máy, khởi động và kiểm tra chương trình trước khi chạy máy luân nhiệt cổ điển theo yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi chép mã thiết bị sử dụng, block sử dụng (nếu có), ngày sử dụng vào (VR- 5.3-QTQL.01-BM.05).
- Sau khi kết thúc quá trình chạy máy, mang các mẫu sang phò ng điện di và tiến hành điện di sản phẩm RT-PCR.

Điện di sản phẩm
- Chuyển sản phẩm PCR vào thạch
+ Đặt thạch vào bể điện di theo đúng chiều dòng điện từ âm sang dương rồi cho TBE 1X ngập bản thạch sao cho dung dich đệm cách mặt thạch từ 1-2mm.
+ Cho dung dịch đệm đặt mẫu (Loading Dye) vào từng giếng của đĩa microtitre hoặc trên giấy parafilm với số lượng tương ứng với số mẫu cần phân tích. Đệm Loading chứa 50% Glycerol vì vậy có tác dụng kéo ADN xuống dưới đáy của giếng điện di và còn chứa Bromophenol Blue có tác dụng đánh dấu ADN trong quá trình chạy.
+ Trộn 9 |nl mỗi sản phẩm PCR với 1 |nl đệm đặt mẫu.
+ Trộn 4 - 5 |al thang chuẩn ADN 100bp hoặc 1000 bp với 1 |al đệm đặt mẫu.
+ Chuyển dung dịch đã được trộn với nhau vào trong các giếng của bản thạch.
+ Đóng nắp của bể điện di , chọn dòng điện 110V và thời gian 30 phút.
+ Tắt máy điện di, chuyển thạch sang máy đọc - Soi và chụp ảnh
+ Đặt bản thạch ngay ngắn trên máy đọc gel, b ât đèn tím để đọc gel và chụp ảnh.

8. Quy trình real-time RT-PCR
Cài đặt thiết bị
- Cài đặt chương trình cho máy Realtime PCR

​

Tra mẫu và chạy máy
- Cho 5µl mẫu RN bệnh phẩm vào tube chứa hỗn hợp phản ứng realtime RTPCR, ly t m nhanh và giữ trong giá tích lạnh.
- Khi tra mẫu phải nh p mã số mẫu vào sơ đ vị trí khung 96 giếng.
Chú ý: Nếu chưa chạy ngay th nên giữ tube ở điều kiện 4oC.
- Đặt các tuýp vào máy, khởi động chương tr nh theo yêu cầu x t nghiệm.

VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

1.Nhận định kết quả RT-PCR

Kết quả được chấp nhận khi:
+ Chứng dương: có băng đặc hiệu tương đương với kích thước của cặp mồi thiết kế.
+ Chứng m phản ứng (NTC), chứng m tách chiết (NEC): m tính.
- Âm tính: s xuất hiện sản phẩm PCR ở các vị trí không đặc hiệu hoặc không có sự hiện diện của sản phẩm PCR.
- Dương tính: sản phẩm PCR đặc hiệu có kích thước theo đúng kích thước chuẩn.
- Kích thước sản phẩm PCR đặc hiệu.

​

- Trong trường hợp kêt quả của phương pháp RT-PCR không cho kết quả rõ ràng hoặc trong trường hợp cần khẳng định chính xác kết quả, phò ng thí nghiệm sẽ xét nghiệm bằng phương pháp Realtime RT-PCR.

2. Nhận định kết quả Realtime-PCR
- Kết quả chỉ đọc được khi:
+ Chứng âm: không có tín hiệu huỳnh quang.
+ Chứng âm tách chiết: không có tín hiệu huỳnh quang.
+ Mẫu dương tính: tín hiệu huỳnh quang được thu nhận trước hoặc tại chu kỳ thứ 38 của phản ứng.
- Nếu trong trường hợp phương pháp Realtime RT - PCR vẫn cho kết quả không rõ thì mẫu bệnh phẩm này sẽ được lặp lại từ bước tách chiết mẫu và có thể chạy song song hai phương pháp RT-PCR và Realtime PCR; hoặc PTN có thể yêu cầu lấy lại bệnh phẩm và xét nghiệm theo thường quy của phòng từ bước nhận bệnh phẩm.
Ghi chép và báo cáo

TÀI LIỆU THAM KHẢO​

1. QIAGEN One Step RT-PCR Kit Handbook, 2002.
2. QuantiTect® Probe RT_PCR Handbook.2011.
3. A Diagnostic Polymerase Chain Reaction Assay for Zika Virus Michelle N.D. Balm, Chun Kiat Lee, Hong Kai Lee, Lily Chiu, Evelyn S.C. Koay, and Julian W. Tang.
4. One-step RT-PCR for detection of Zika virus Oumar Faye, Ousmane Faye, Anne Dupressoir, Manfred Weidmann, Mady Ndiaye, Amadou Alpha Sall.
Genetic and Serologic Properties of Zika Virus Associated with an Epidemic, Yap State, Micronesia, 2007 Robert S. Lanciotti, Olga L. Kosoy, Janeen J. Laven, Jason O. Velez, Amy J. Lambert, Alison J. Johnson, Stephanie M. Stanfield, and Mark R. Duffy.

Nguồn: Quyết định 3336/QĐ-BYT ngày 20/7/2017 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc ban hành tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật Huyết học - Truyền máu - Miễn dịch - Di truyền - Sinh học phân tử.