Thảo luận [SOPs] XÉT NGHIỆM GIẢI TRÌNH Tự GEN TRÊN HỆ THỐNG MISEQ

XÉT NGHIỆM GIẢI TRÌNH Tự GEN
TRÊN HỆ THỐNG MISEQ
(Gene sequencing on Illumina MiSeq system)​

I. NGUYÊN LÝ
Kỹ thuật giải trình tự gen trên hệ thống MiSeq dựa trên nguyên lý tổng hợp chuỗi (synthesis-based) bổ sung với gen đích; trong đó mỗi loại nucleotit sử dụng trong phản ứng giải trình tự được đánh dấu với một chất huỳnh quang khác nhau và được phát hiện bằng hệ thống quang học. Từ đó cho phép xác định chính xác trình tự sắp xếp các nucleotit trên chuỗi ADN hoặc ARN.

II. CHỈ ĐỊNH
Chỉ định cho các người bệnh bị bệnh máu để phát hiện các đột biến gen gây bệnh.

III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định

IV. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
Nhân viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo.
2. Thiết bị - hoá chất
2.1. Thiết bị, vật tư tiêu hao:
- Pipet: 0,2-2pl, 1-10pl, 10-100pl, 20-200pl, 100-1000pl;
- Đầu côn RNAse-free, có màng lọc, loại 0,2-2pl, 1-10pl, 10-100pl, 20-200pl, 100-1000pl;
- Ông ly tâm 1,7ml RNAse-free và ống ly tâm không nắp 2ml;
- Ông PCR 0,2ml, RNAse-free;
- Ông real-time PCR 0,2ml, RNAse-free;
- Ông đo nồng độ ADN/ARN (Qubit)
- Ông falcon: 10ml, 50ml;
- Dao cắt gel;
- Giá từ;
- Máy ly tâm lạnh, để bàn;
- Máy lắc ủ nhiệt;
- Máy PCR;
- Máy lắc (vortex);
- Máy đo nồ ng độ ADN/ARN Nanodrop, Qubit 2.0;
- Hệ thống điện di và chụp ảnh gel;
- Hệ thống đọc trình tự gen MiSeq;
- Máy tính cấu hình cao (khuyến nghị: Core i7, 16-32Gb RAM, 1-2Gb VRAM đồ hoạ, ổ cứng SSD 1TB) và phần mềm phân tích kết quả.
2.2. Sinh phẩm và hoá chất:
- Agarose;
- Thuốc nhuộm gel;
- Loading dye;
- Gel marker;
- Đệm điện di TBE;
- H2O dùng cho sinh học phân tử, RNAse-free
- C ồ n tuyệt đối ethanol và isopropanol dùng cho sinh học phân tử;
- Kit tách chiết ADN/ARN (QIAGene);
- Kit thôi gel (QIAGene);
- Kit tổng hợp cDNA (Invitrogen);
- Kit đo nồng độ ADN (Qubit)
- Kit chuẩn bị thư viện (Illumina Nextera XT);
- Kit định lượng thư viện (KAPA RQ-PCR library quatiíỉcation);
- Kit chuẩn hoá thư viện (Sigma AMPure XP);
- Kit đọc trình tự gen (Ihumina MiSeq reagent kit v2 300 cycles);
3. Mẫu xét nghiệm
2ml máu ngoại vi hoặc dịch tuỷ xương đựng trong ống chống đông với EDTA.

V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Tách chiết vật liệu di truyền (ADN/ARN) từ mẫu máu ngoại vi hoặc dịch tuỷ xương (sử dụng kit QIAGene) :
- Thu tế bào bạch cầu buffy coat, rửa và tái huyền dịch trong 200ul PBS 1X;
- Chuyển 200u1 tế bào bạch cầu sang ống ly tâm 1,7m1;
- Thêm vào mỗi ống 400ul đệm RLT, trộn đều bằng bơm tiêm;
- Thêm vào mỗi ống 400ul ethanol 70%, trộn đều bằng đảo ngược ống;
- Chuyển toàn bộ dịch vào cột tách chiết, ly t âm 1 phút ở 10.000 vòng/phút, loại bỏ phần dịch ở đáy ống;
- Thêm vào mỗi cột 700pl dung dịch RW1, ly tâm 1 phút ở 10.000 vòng/phút, loại bỏ phần dịch ở đáy ống;
- Thêm vào mỗi cột 500pl dung dịch RPE, ly tâm 1 phút ở 10.000 vò ng/phút, loại bỏ phần dịch ở đáy ống;
- Chuyển cột sang ống 2ml mới, ly tâm 1 phút ở 10.000 vò ng/phút, loại bỏ phần dịch ở đáy ống;
- Chuyển cột sang ống ly tâm 1,7ml mới, thêm vào mỗi cột 50pl H2O, để ở nhiệt độ phò ng 5 phút, ly tâm 1 phút ở 10.000 vò ng/phút. Phần dịch thu được là RNA đã được tinh sạch;
- Đo nồng độ RNA bằng NanoDrop và bảo quản mẫu ở -80oC.
2. Thực hiện phản ứng phiên mã ngược (cDNA)
- Sử dụng 10pg-1pg RNA để thực hiện phản ứng cDNA với kit SuperScript VILO cDNA Synthesis kit;
- Chuẩn bị phản ứng theo bảng dưới đây:

​

- Chu trình nhiệt cho phản ứng tổng hợp cDNA :
|25oC 10’ 42oC 60’ 85oC 5’|
- Sản phẩm cDNA được bảo quản ở -20oC.
3. Phân lập gen đích
Phân l âp gen đích từ cDNA tổng số bằng PCR với bộ mồi phù hợp (tham khảo quy trình PCR chuẩn). Gen đích là đoạn hoặc các đoạn ADN cần phân tích, phục vụ chẩn đoán và điều trị cho mỗi loại bệnh khác nhau.
4. Tiinh sạch gen đích bằng phương pháp thôi gel
- Điện di sản phẩm PCR (gen đích) trên gel agarose 1%, sử dụng marker phù hợp để định vị chính xác gen đích;
- Cắt khúc gel chứa băng sản phẩm cho vào ống ly tâm 1,7ml và xác định trọng
lượng;
- Sử dụng kit QIAGene MinElute Gel Extraction kit để tinh sạch sản phẩm PCR. Tất cả các bước ly tâm đều thực hiện ở vò ng quay > 10.000g;
- Cho vào mỗi ống chứa sản phẩm PCR 3 lần thể tích đệm QG (mỗi 1mg gel được quy ước tương đương với 1 ul thể tích);
- Ủ ở 500C trong 10 phút để gel tan hoàn toàn;
- Thêm 1x thể tích cồn isopropanol (ví dụ: 100 ul cồ n đối với 100mg gel) đảo nhẹ và chuyển toàn bộ dung dịch vào cột MinElute;
- Ly tâm cột MinElute 1 phút, loại bỏ dịch ở đáy ống;
- Cho vào mỗi cột 500 ul đệm QG, ly tâm 1 phút, loại bỏ dịch ở đáy ống;
- Cho vào mỗi cột 750 ul đệm PE, ly tâm 1 phút, loại b ỏ dịch ở đáy ống;
- Chuyển cột sang ống ly tâm mới, ly tâm 1 phút, loại bỏ dịch ở đáy ống;
- Chuyển cột sang ống ly tâm 1,5ml, thêm vào mỗi cột 10 ul đệm EB (hoặc H2O), để ở nhiệt độ phòng 1 phút;
- Ly tâm cột 1 phút, thu dịch chứa ADN (gen) đích, đo nồng độ bằng NanoDrop, bảo quản ở -20oC.

5. Chuẩn bị thư viện DNA
5.1. Phân mảnh DNA thành các đoạn có chiều dài khoảng 300 bp
Chuẩn bị:
- Rã đông các ống ATM (Amplicon Tagment Mix), TD (Tagment DNA Buffer), và các mẫu DNA, giữ trong khay đá;
- Làm ấm ống NT (Neutralize Tagment Buffer) đến nhiệt độ phò ng;
- Sau khi rã đông, nhẹ nhàng đảo ngược các ống hóa chất 3-5 lần để trộn đều.
Các bước thực hiện:
- Ký hiệu ống PCR mới là NTA;
- Cho 10 ^l dung dich đệm TD vào mỗi ống;
- Cho 5 ^l hỗn hợp DNA của từng mẫu vào mỗi ống NTA riêng biệt;
- Thêm 5 ^l ATM vào các ống, hút nhả pipet 5 lần;
- Đây nắp các ống và ly tâm ở 280g, 20oC, trong 1 phút để đảm bảo các hóa chất được tâp trung ở phần đáy ống;
- Đưa các ống NTA vào máy PCR, ủ ở nhiệt độ 55oC trong 5 phút, sau đó giữ ở 1oC;
- Thêm vào mỗi ống NTA 5 ul đệm, trộn đều bằng pipet 5 lần;
Đây nắp và ly tâm ở 280g, 20oC, trong 1 phút;
Ủ các ống NTA ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để bất hoạt hoàn toàn enzyme.
5.2. Gắn mã đánh dấu (barcode)
Chuẩn bị:
- Rã đông hóa chất NPM (Nextera PCR Master Mix) và các index ở nhiệt độ phòng trong khoảng 20 phút, nhẹ nhàng đảo ống 3-5 lần.
Các bước thực hiện:
- Đặt các ống NT A theo thứ tự cố định trên đĩa TruSeq Index Plate Fixture;
- Thêm 15 ul mastermix NPM vào từng ống NTA;
- Thêm vào mỗi ống NTA 5 ul index 1 và 5 ul index 2 theo tổ hợp để phân biệt các mẫu phân tích;
- Loại b ỏ tất cả các nắp index đã dùng và thay bằng nắp mới (cung cấp theo kit);
- Đây nắp các ống và ly tâm ở 280g, 20oC, trong 1 phút;
Tiến hành phản ứng PCR để gắn index theo chương trình sau:

​

Sơ đồ phối hợp mã đánh dấu (barcode):​

​

5.3. Tinh sạch sản phẩm bằng hạt từ (AMPure XP)
Chuẩn bị:
- Đưa dung dịch chứa hạt từ AMPure XP về nhiệt độ phò ng;
- Chuẩn bị cồn ethanol 80%.
Các bước thực hiện:
- Ly tâm ống NTA ở 280g trong 1 phút (20oC);
- Đánh dấu ống ly tâm 1,5, l mới là CAA;
- Chuyển 50 pl sản phẩm PCR từ ống NTA sang ống CAA;
- Trộn đều dung dịch AMPure XP trong 30 gi ây bằng vortex, thêm 90 pl AMPure XP vào từng ống CAA, trộn đều bằng pipet;
- Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để DNA bám vào các hạt từ;
- Đặt ống trên giá từ trong 2 phút, để giữ hạt từ;
- Dùng pipet loại bỏ toàn bộ dịch trong ống;
- Giữ nguyên ống CAA trên giá từ, thêm 200 pl ethanol 80% vào các ống, ủ 30 giây, loại bỏ dung dịch bằng pipet (thực hiện bước này 2 lần);
- Giữ nguyên các ống CAA trên giá từ, để khô tự nhiên trong 15 phút;
- Nhấc các ống CAA khỏ i giá từ, dùng pipet thêm 50 pl đệm RSB vào từng ống CAA, trộn đều bằng pipet;
- Ủ ở nhiệt độ phòng 2 phút. Sau đó đặt các ống lên giá từ trong 2 phút, dung pipet thu phần dung dịch (chứa DNA) đã tách ra khỏ i hạt từ. Ký hiệu các ống mẫu là
CAN;
- Đo nồ ng độ bằng Qubit 2.0;
- Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -20oC.
5.4. Định lượng mẫu bằng RQ-PCR Chuẩn bị:
- Pha loãng các mẫu sau khi tinh sạch theo tỷ lệ như sau:
+ Nồ ng độ DNA < 2 ng/pl: pha loãng 1.000 lần.
+ Nồ ng độ DNA từ 2 đến 10 ng/pl: pha loãng 5.000 lần.
+ Nồng độ DNA từ 10 đến 30 ng/pl: pha loãng 10.000 lần.
+ Nồng độ DNA >30 ng/pl: pha loãng 20.000 lần.
Chương trình chạy RQ-PCR:
Công thức pha hỗn hợp phản ứng:

​

- Mỗi mẫu chạy lặp lại 3 lần để tính giá trị trung bình;
- Kết quả định lượng bằng RQ-PCR được tính toán với kết quả đo bằng Qubit để tính giá trị trung bình của mỗi mẫu, đây là giá trị nồng độ cuối cùng của các mẫu dùng để tính toán lượng mẫu đưa vào đọc trình tự.

5.5. Chuẩn hóa mẫu
Chuẩn bị:​

- Rã đông ống LNA1 và làm ấm đến đến nhiệt độ phò ng;
- Làm ấm ống LNB1 và LNW1 đến nhiệt độ phò ng;
- Trộn đều ống LNB1 bằng vortex trong 1 phút;
- Làm ấm ống LNS1 về nhiệt độ phòng.

Các bước thực hiện:​

- Đánh dấu một ống ly tâm 1,5ml sạch là LNP;
- Chuyển 20 ql dịch sản phẩm từ ống CAN ống LNP;
- Hút 1,1 ml LNA1 vào 1 ống ly tâm 1,5 ml.
- Trộn đều hạt từ trong ống LNB1 bằng pipet;
- Hút 45 ql hỗn hợp LNA1/LNB1 vào mỗi ống LNP đã chứa sẵn mẫu;
- Lắc các ống LNP trên ở vân tốc 1.800 vò ng/phút trong 30 phút;
- Đặt các ống trên giá từ trong 2 phút, loại b ỏ dung dịch bằng pipet;
- Nhấc các ống LNP ra khỏ i giá từ và tiến hành bước rửa với LNW1:
+ Thêm 45 ql LNW1 mỗi ống.
+ Đóng chặt nắp các ống.
+ Lắc với vân tốc 1.800 rpm trong 5 phút.
+ Đặt các ống trên gía từ trong 2 phút.
+ Cẩn thân loại bỏ dịch nổi, thay đầu côn sau mỗi lần thao tác.
- Lặp lại bước rửa một lần nữa với LNW1;

- Nhấc các ống LNP khỏ i giá từ, thêm 30 ql NaOH 0,1 N vào các ống, lắc ống LNP tại vân tốc 1.800 vò ng/phút, trong 5 phút;
- Trong khi lắc, chuẩn bị ống PCR, ký hiệu là SGP, và cho vào mỗi ống 30 ql dung dịch LNS1;
- Đặt các ống LNP trên giá từ trong 2 phút. Chuyển phần dung dịch chứa DNA sang ống SGP;
- Đo nồ ng độ bằng Qubit 2.0 và kit định lượng thư viện (KAPA library quantification).​

- Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -20oC.

6. Giải trình tự gen trên máy MiSeq

- Đối với bộ hoá chất đọc trình tự Reagent cartridge V2 300cycles, lượng mẫu đưa vào có nồ ng độ tối ưu là 12pMol;
- Pha loãng các mẫu và trộn tất cả các mẫu phân tích vào cùng 1 ống ly tâm và thêm dung dịch HT1 để đạt nồ ng độ cuối cùng là 12pMol.​

Chuẩn bị mẫu
- Điều chỉnh block nhiệt cho ống 1,5 ml đến 96oC;
- Rã đông hóa chất MiSeq reagent, để ở nhiệt độ phòng;
- Chuẩn bị một hộp nước đá với tỷ lệ 3 đá - 1 nước;
- Làm ấm các ống SGP đến nhiệt độ phò ng, trộn đều bằng pipet;
- Ký hiệu 1 ống ly tâm 1,5ml là ống PAL;
- Chuyển 10 gl của mỗi mẫu trong mỗi ống SGP vào ống PAL;
- Ký hiệu 1 ống ly tâm 1,5ml mới là ống DAL;
- Thêm 576 gl HT1 vào ống DAL;

- Chuyển 24 gl hỗn hợp DNA từ PAL vào ống DAL (có chứa HT1), trộn đều bằng pipet;​

- Trộn ống DAL bằng vortex với tốc độ cao nhất;

- Đưa ống DAL vào block nhiệt ở 96oC, ủ trong 2 phút để đảm bảo các sợi DNA bị biến tính hoàn toàn;​

- Đảo nghịch ống DAL 1-2 lần, đăt vào hộp nước đá, để trong vò ng 5 phút;

- Đưa toàn bộ hỗn hợp trong ống DAL vào khay đọc trình tự (MiSeq reagent cartridge).​

Các bước tiến hành đọc trình tự gen
- Khởi động máy trước khi chạy 15 phút;

- Khởi động chương trình Experiment manager để khai báo thông tin mẫu và thiết l p quy tr nh chạy;​

- Khởi động chương trình MiSeq control;
- Nạp hoá chất và khay mẫu vào vị trí tương ứng trên máy;

- Kiểm tra xác nhận của máy, khai báo thông tin trên màn hình và tiến hành đọc tr nh t .​

Kết thúc đọc trình tự gen
- Kiểm tra bảng thông báo kết quả đọc trình tự gen;
- Tiến hành bước rửa thiết bị (post-run wash) theo hướng dẫn trên màn hình.

VI. PHÂN TÍCH KẾT QUẢ
1. Phân tích kết quả bước 1 (primary data analysis): là bước đối chiếu, xắp xếp các đoạn đọc trình tự ngắn, thu được từ quá trình giải trình tự, thành các trình tự dài hơn (contig) và cuối cùng là các trình tự hoàn chỉnh (gene hoặc genome). Bước này được thực hiện tự động với các chương trình, thuật toán cài đặt sẵn trong bộ công cụ phân tích hệ gen (GATK).
2. Phân tích kết quả bước 2 (secondary data analysis): là bước phân tích dữ liệu theo hướng quan tâm (như xác định đột biến, đa hình di truyền,...). Đối với hệ thống MiSeq, công cụ MiSeq reporter, cài đặt sẵn, phục vụ đầy đủ các mục đích cơ bản. Ngoài ra, có nhiều công cụ tin-sinh khác (CLC genomic workbench, Avadis,...) có thể được sử dụng để phân tích và khai thác dữ liệu ở mức độ sâu hơn.


VII. SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

​

TÀI LIỆU THAM KHẢO​

1. Quy trì nh tách RNA từ dịch cơ thể (máu toàn phần, dịch tuỷ xương,...) của QIAGene: RNeasy_Mini_Handbook;
2. Quy trình PCR và RT-PCR của Invitrogen: Superscript onestep RT-PCR manual;
3. Quy trì nh tách chiết và tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose của QIAGene: MinElute Handbook;
4. Quy trình đo nồng độ thư viện bằng Qubit: Qubit 2.0 Fluorometer manual;
5. Quy trì nh định lượng nồng độ thư viện bằng RQ-PCR của KAPA: KAPA Library Quantification for Illumina;
6. Quy trì nh chuẩn bị thư viện giải trình tự của Illumina: Illumina Nextera XT library preparation protocol;
7. Quy trình đọc trình tự gen trên hệ thống MiSeq: Illumina MiSeq operation manual.
8. Các tài liệu chuẩn khác về thao tác với mẫu dịch cơ thể, ADN/ARN, PCR, RT- PCR, real-time PCR, RQ-PCR, đo nồ ng độ ADN/ARN,...
9. Tài liệu hướng dẫn sử dụng phần mềm MiSeq reporter của Illumina: Illumina MiSeq reporter user manual.
Các tài liệu khác về phân tích dữ liệu tin-sinh học.

Nguồn: Quyết định 3336/QĐ-BYT ngày 20/7/2017 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc ban hành tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật Huyết học - Truyền máu - Miễn dịch - Di truyền - Sinh học phân tử.