Thảo luận [SOPs] Xác định kháng nguyên nhóm máu - Kỹ thuật sinh học phân tử

XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN NHÓM MÁU
(Kỹ thuật sinh học phân tử)​

I. NGUYÊN LÝ
Dựa trên kỹ thuật PCR-SSP (Kỹ thuật PCR với những đoạn mồi có trình tự đặc hiệu với alen): Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) cho phép khuếch đại trình tự ADN đã được xác định, sau khi khuếch đại thành công, chuỗ i AND đích được nhân lên với lượng vừa đủ.
Để có thể phân tích kết quả phản ứng PCR-SSP, nhiều phản ứng khuếch đại đã được thực hiện đồng thời. Những mẫu PCR gắn với đoạn mồi đặc hiệu sẽ được khuếch đại sau phản ứng PCR, trong khi những mẫu không gắn với đoạn mồi đặc hiệu thì sẽ không được khuếch đại sau phản ứng PCR.
Đoạn mồi cũng dùng để khuếch đại một chứng nội kiểm (một đoạn gen của hormon tăng trưởng người: HGH), nếu không có sản phẩm đặc hiệu sau phản ứng PCR, chứng dương vẫn phải cho kết quả rõ ràng.
Việc phát hiện của các sản phẩm PCR được thực hiện bằng cách đo các tín hiệu huỳnh quang và không cần điện di sản phẩm bằng gel như trong các hệ thống PCR thông thường.

II.CHỈ ĐỊNH
Xác định kháng nguyên nhóm máu, nhóm máu bằng phương pháp sinh học phân tử trong trường hợp:
- Người bệnh có kết quả nghiệm pháp Coombs trực tiếp dương tính;
- Người bệnh thalassemia mới truyền máu, truyền máu nhiều lần cần xác định các kháng nguyên nhóm máu;
- Người bệnh ghép tế bào gốc đồng loài có bất đồng các kháng nguyên nhóm máu với người cho;
- Người cho tế bào gốc để ghép cho người bệnh;
- Người bệnh có nhóm máu D yếu, D từng phần, D âm;
- Người bệnh có nhóm máu hệ ABO khó xác định bằng phương pháp huyết thanh học.

III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.

IV. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
Bác sỹ, cử nhân, kỹ thuật viên, điều dưỡng trung học.
2. Phương tiện
2.1. Trang thiết bị, dụng cụ, vật tư tiêu hao
- Hệ thống máy tự động FluoGene để xác định kháng nguyên nhóm máu;
- Máy đọc huỳnh quang FluoVista Analyzer của Đức;
- Phần mềm FluoGene;
- Máy ly tâm ống eppendorf;
- Máy lắc ủ nhiệt Thermomixer compact;
- Máy vortex;
- Máy OD đo nồng độ AND chuyên dụng;
- Fluo-Pad, khay nén để làm xét nghiệm PCR;
- Fluo-App, dụng cụ ấn tấm bảo vệ lên trên mặt khay PCR;
- Máy Thermal cycler;
- Tủ lạnh bảo quản sinh phẩm.
- Ống nghiệm eppendorf 1,5 ml, 2 ml;
- Pipet tự động có thể tích 1 đến 100 ^l và 100 đến 1000 ^l;
- Đầu côn có phin lọc; pipetman; ống nghiệm thủy tinh; pipet nhựa.
2.2. Thuốc thử và hoá chất
- Hóa chất - sinh phẩm để tách chiết AND: Bộ kít E.Z.N.A Blood DNA kit.
- Bộ kít để xác định kháng nguyên nhóm máu bằng phương pháp PCR- SSP: Bộ kít RBC-FluoGene ABO basic: Xác định kháng nguyên nhóm máu hệ ABO: A1, A2, B, O1, O2; Bộ kít RBC-FluoGene VERYfy: Xác định nhiều hệ nhóm máu RhD exon 1, 5, 10, psi, C, c, E, e, Cw, Kel 1, Kel 2, Jka, Jkb, Fya, Fyb, FyX, Fy null, M, N, S, s, Dombrock a/b; Bộ kít RBC-FluoGene D screen: Xác định kháng nguyên D (Exone 3, 5 và 10 của gen RHD).
Một bộ kít trên bao gồm:
- Ống Fluomix: Một ống sử dụng hết cho 1 xét nghiệm, trong ống gồm có: dNTPs, PCR buffer và Taq Polymerase;
- Nước cất (không có huỳnh quang);
- Miếng dán bảo vệ trong suốt;
- Phiến PCR 96 giếng (màu trắng, được dán barcode): Mỗi giếng chứa hỗn hợp oligonucleotide được chia nhỏ và đông khô cho phép khuếch đại những gen đích. Mỗ i phần của hỗn hợp này bao gồm đoạn mồi và đoạn dò được gắn tín hiệu huỳnh quang khác nhau:
+ Một đầu dò đặc hiệu với alen (tín hiệu huỳnh quang 1).
+ Một đầu dò đặc hiệu HGH để khuếch đại chứng nội kiểm (tín hiệu huỳnh quang 2).
+ Có thể thêm một đầu dò đặc hiệu trong trường hợp nhiều phản ứng (tín hiệu huỳnh quang 3).
2.3. Mau bệnh phẩm: 2 ml máu tĩnh mạch có chống đông bằng EDTA của người bệnh.
3. Thời gian làm xét nghiệm: 24 giờ.

3. CÁC BỨOC TIẾN HÀNH
1. Chuẩn bị dụng cụ, hoá chất, sinh phẩm, trang thiết bị trước khi làm xét nghiệm.

2. Nhận mẫu máu và phiếu chỉ định xét nghiệm, kiểm tra và đối chiếu các thông tin trên mẫu máu với phiếu chỉ định xét nghiệm. Kiểm tra về số lượng và chất lượng mẫu máu.

3. Tiến hành xét nghiệm
3.1. Tách ADN từ mẫu máu toàn phần của người bệnh
- Chuẩn bị một ống eppendorf loại 1,5 ml, ghi tên người bệnh lên nắp và thân ống;
- Nhỏ vào ống eppendorf đã chuẩn bị ở trên 200 pl máu toàn phần;
- Thêm vào ống eppendorf trên 50 pl dung dịch elution buffer;
- Thêm 25 pl dung dịch OB protease solution và 250 pl dung dịch BL buffer vào ống eppendorf trên. Trộn mạnh các sinh phẩm trong ống eppendorf bằng máy máy vortex trong vòng 10 giây;
- Ủ ống nghiệm trên ở 65oC, lắc ống với tốc độ 300 vòng/ phút trong vòng 10 phút bằng máy lắc ủ nhiệt thermomixer compact;
- Thêm 260 pl cồn 96%, trộn đều trong vòng 10 giây;
- Chuẩn bị cột chiết tách ADN, ghi tên người bệnh lên nắp cột;
- Chuyển toàn bộ dịch trong ống eppendorf lên cột chiết tách ADN;
- Ly tâm cột chiết tách ADN với tốc độ 13.000 vòng/ phút trong vòng 1 phút, chuyển cột chiết tách ADN sang ống eppendorf mới loại 2 ml;
- Thêm 500 pl dung dịch HCB buffer;
- Ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/ phút trong 1 phút, loại bỏ dịch qua cột.
- Thêm 700 pl DNA wash buffer;
- Ly tâm cột chiết tách ADN với tốc độ 13.000 vòng/ phút trong vòng 1 phút, loại bỏ dịch qua cột. Chuyển cột chiết tách ADN sang ống eppendorf mới loại 2 ml;
- Ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/ phút trong vòng 2 phút;
- Chuẩn bị một ống eppendorf mới, ghi tên người bệnh lên nắp và thành ống; Chuyển cột chiết tách ADN sang ống eppendorf mới đã chuẩn bị ở trên;
- Thêm 100 pl dung dịch elution buffer vào ống eppendorf trên, ủ ống eppendorf trên ở nhiệt độ phòng trong vòng 5 phút;
- Ly tâm ống eppendorf với tốc độ 14.000 vòng/ phút trong 1 phút;
- Dung dịch thu được là ADN.
3.2. Đo nồng độ và độ tinh sạch ADN
- Bật máy đo OD chuyên dụng;
- Chọn chương trình đo AND;
- Pha loãng ADN theo tỷ lệ 1: 20 với thể tích 100 ^l;
- Chuẩn máy về blank sử dụng dung dịch nước cất;
- Nhập tỷ lệ pha loãng vào máy;
- Cho mẫu vào máy đo. Máy OD sẽ hiển thị các thông số: nồng độ của mẫu (^g/ml), tỷ lệ pha loãng, độ tinh sạch mẫu thông qua tỷ lệ A260/A280 (mẫu đạt tiêu chuẩn tinh sạch khi tỷ lệ A260/A280 ở trong giới hạn từ 1,7 đến 2);
- In kết quả sau khi kết thúc và tắt máy.
3.3. Phản ứng PCR
Phản ứng PCR đối với kít RBC-FluoGene ABO basic và RBC-FluoGene VERYfy:
- Rã đông khay PCR, dung dịch fluoMix và mẫu ADN;
- Trước khi bóc tấm bảo vệ phủ lên phiến PCR, kiểm tra về số lô và hạn sử dụng của bộ kít. Chứng âm/ chứng dương có trong giếng được đánh dấu bằng vạch màu đen;
- FluoMix là dung dịch dùng ngay và đã được chia sẵn thể tích cho một lần định nhóm trong mỗi ống. Trước khi thêm ADN, lắc đều FluoMix và nhỏ 7,5 ul vào giếng chứa chứng âm và chứng dương;
- Thêm 7,5 ul nước cất (không có huỳnh quang) vào giếng chứa chứng âm;
- Sau đó, thêm ADN pha loãng (nồng độ 1 ng/ul ± 50%) vào ống FluoMix còn lại (theo như bảng dưới đây), lắc trộn kỹ và nhỏ 15 ul vào các giếng phản ứng (giếng có màu xanh trên từng khay PCR), hoặc có thể nhỏ trực tiếp ADN vào ống FluoMix và pha loãng với nước để được thể tích cuối cùng. Lượng ADN cuối cùng và thể tích tổng cuối cùng được thể hiện trong bảng dưới đây:

​

- Phủ phiến PCR bằng tấm bảo vệ trong suốt, tránh dấu vân tay và làm bẩn tấm bảo vệ;
- Gõ nhẹ khay PCR để đảm bảo tất cả dung dịch rơi xuống đáy của giếng phản ứng, tránh để dung dịch bắn và dính vào tấm bảo vệ trong suốt quá trình thao tác;
- Việc đọc trước phản ứng phải được thực hiện trong vòng 15 phút sau khi thiết lập phản ứng PCR. Chuyển phiến vào máy phân tích FluoVista của hàng Inno-train và thực hiện việc đọc trước phản ứng;
- Chuyển khay PCR vào máy thermalcycler, đậy lại bằng một miếng đệm nén sạch, VD: FluoPad của inno-train và đảm bảo nắp đậy được làm nóng là sạch và khởi động chương trình PCR.
Phản ứng PCR đối với kít D-Screen
- Phiến PCR không chứa chứng âm. Nhỏ trực tiếp 7.5 ul dung dịch FluoMix và 7.5 ul nước cất vào giếng.
- Lượng ADN cuối cùng và thể tích tổng cuối cùng được thể hiện trong bảng dưới đây:

​

Chương trình PCR (sử dụng cho mọi bộ kít RBC-FluoGene)

​

3.5. Đọc huỳnh quang

Đo huỳnh quang điểm cuối thực hiện trên máy phân tích Inno-train Fluo Vista Analyzer. Đảm bảo hơi nước không đọng trên tấm bảo vệ và việc đọc kết quả cần thực hiện trong vòng 15 phút sau chu trình nhiệt.

3.6. Tính toán số liệu

Được thực hiện tự động bằng phần mềm FluoGene.



I. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

- Phản ứng dương tính: Có sản phẩm PCR, phát tín hiệu huỳnh quang và được phát hiện bằng máy đọc huỳnh quang: Có kháng nguyên cần xác định trên hồng cầu;

- Phản ứng âm tính: Không có sản phẩm PCR, không phát tín hiệu huỳnh quang: Không có kháng nguyên cần xác định trên hồng cầu.



Những điểm cần chú ý khi làm xét nghiêm:

- Đọc kỹ các bước của quy trình hướng dẫn trước khi tiến hành kỹ thuật;

- Tuân thủ đúng các hướng dẫn sử dụng sinh phẩm của nhà sản xuất sinh phẩm;

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Hướng dẫn sử dụng bộ kít E.Z.N.A Blood DNA kit của hãng Omega.

2. Hướng dẫn sử dụng máy OD đo nồng độ ADN của hãng Biorad.

3. Hướng dẫn sử dụng bộ kít RBC-FluoGene ABO basic của hãng Inno-Train, Đức.

4. Hướng dẫn sử dụng bộ kít RBC-FluoGene VERYfy của hãng Inno-Train, Đức.

Hướng dẫn sử dụng bộ kít RBC-FluoGene D screen của hãng Inno-Train, Đức.