Thảo luận [SOPs] QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM GEN BẰNG KỸ THUẬT cIg FISH

QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM GEN BẰNG KỸ THUẬT cIg FISH
(Cytoplasmic Immunoglobulin Staining and Fluorescence in situ hybridization)
​

I. NGUYÊN LÝ
Kỹ thuật cIg FISH là sự phối hợp 2 kỹ thuật là nhuộm bào tương của tế bào plasmo (tương bào) và kỹ thuật FISH.
Kỹ thuật nhuộm bào tương của tế bào plasmo được tiến hành theo nguyên lý: bào tương của tế bào plasmo biểu hiện rất nhiều kháng thể có chuỗi nhẹ kappa hoặc lambda. Sử dụng các kháng kháng thể đơn dò ng (anti-kappa hoặc anti-lambda) đã được gắn huỳnh quang để nhuộm bào tương của tương bào sẽ giúp xác định dễ dàng các tế bào này thông qua kính hiển vi huỳnh quang với màng lọc phù hợp
Kỹ thuật FISH được tiến hành dựa trên cơ sở của phản ứng lai ghép. Trong tế bào, phân tử ADN tồn tại dưới dạng phân tử kép gồm 2 chuỗi đơn gắn kết bổ sung với nhau thông qua liên kết hydro. Liên kết hydro là liên kết yếu nên dễ dàng bị đứt gãy dưới tác động của nhiệt độ hay pH cao. Lúc đó, phân tử AlDN bị tách thành 2 chuỗi đơn. Tuy nhiên khi nhiệt độ hay pH giảm, các chuỗi đơn lại ghép nhau theo nguyên tắc bổ sung.
Dựa trên đặc tính này, kỹ thuật FISH sử dụng các probe là đoạn AlDN đặc hiệu có gắn huỳnh quang để lai ghép với các đoạn AlDN tương đồng trên nhiễm sắc thể. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện bất thường nhiễm sắc thể một cách chính xác và nhanh chóng.
Sử dụng kỹ thuật cIg FISH giúp đánh giá những tổn thương di truyền khu trú trên d ng tế bào plasmo ác tính nên tránh được m tính giả.

II. CHỈ ĐỊNH
Chỉ định cho người bệnh đa u tủy xương, các bệnh lý liên quan đến tế bào lympho B.

III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.

IV. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
Nhân viên xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử đã được đào tạo.
2. Phương tiện, hóa chất
2.1. Phương tiện
- Thiết bị: bể ổn nhiệt, máy lai, máy ly tâm, máy trộn mẫu, và kính hiển vi huỳnh
quang.
- Dụng cụ: kẹp kim loại, 10 cóng Coplin, nhiệt kế, coverslip 22x22, pipetman 100 pl, 10 pl, xi măng cao su, ống đong, giấy thấm.
2.2. Hóa chất
- Probe phù hợp tương ứng với đoạn gen cần phát hiện.
- Dung dịch 10% formamide: 5 ml formamide + 30 ml H2O + 15 ml 20X SSC.
- Dung dịch 2X SSC.
- Dung dịch rửa 0,1% NP40: 2X SSC + 0,1% NP40.
- Dung dịch rửa 0,3% NP-40: 0,4X SSC + 0,3% NP40.
- CỒn 70o, 85o, 100o.
- Ficoll Paque.
- Dung dịch PBS 1X.
- Dung dịch SSC 20X.
- Dung dịch nhược trương: KCL 0,075M (PH=7,4). (5 ml/1 mẫu).
- Methanol tuyệt đối.
- Acid acetic.
- Mounting medium without DAPI.
- AMCA Goat Anti human lambda chain antibody.
- AMCA Goat Anti human kappa chain antibody.
- AMCA Rabbit Anti goat IgG antibody.
- LSI/WCP Hybridization Buffer.

3. Bệnh phẩm
2 ml dịch hút tủy xương của người bệnh đựng trong ống chống đông Sodium heparin.

V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Chuẩn bị tiêu bản
Sau khi có dịch hút tủy xương của người bệnh, cần tiến hành ké o tiêu bản và phân tích tỷ lệ tương bào. Với những mẫu có tỷ lệ tương bào lớn hơn 10%, thực hiện các bước chuẩn bị tiêu bản như sau:
B1: Tách tế bào đơn nhân bằng ficoll:
- Cho toàn bộ dịch tủy của người bệnh vào ống falcon 15 ml. Cho thêm dung dịch PBS 1X đến 3,3 ml.
- Thêm 1ml ficoll vào (lưu ý cho đầu côn chứa ficoll xuống đáy ống falcon). Ly t âm 2100 vò ng/phút trong 30 phút với chế độ “ no brake” cho máy ly tâm.
- Dùng pipet để bỏ phần huyền dịch phía trên chứa huyết tương và tiểu cầu. Sử dụng pipet khác để chuyển phần tế bào đơn nhân sang ống falcon khác.
- Rửa bằng cách cho thêm PBS vào phần tế bào đơn nhân theo tỷ lệ 3:1. Ly tâm 1400 vò ng/phút trong 10 phút.
- Tái huyền dịch bằng PBS.
B2. Nhược trương tế bào:
- Xử lý tế bào đơn nhân bằng 5ml dung dịch KCl 0,075M trong 5 phút. Sau đó cho thêm 01 ml dung dịch Cornoy II (3 methanol: 1 acid acetic), trộn đều rồ i đem ly t âm 1000 vò ng/phút trong 10 phút.
- Loại b ỏ dịch nổi.
B3. Cố định tiêu bản:
- Cho thêm 5ml dung dịch Cornoy II. Để ở nhiệt độ phò ng trong 10 phút.
- Ly tâm 1000 vò ng/phút trong 10 phút.
- Loại b dịch nổi.
- Cho thêm 5 ml c ồ n 96o. Ly t âm 1000 vò ng/phút trong 10 phút.
- Tái huyền dịch để có nồ ng độ tế bào phù hợp, nhỏ cặn tế bào lên lam kính.
2. Lai huỳnh quang tại chỗ
2.1. Xử lý tiêu bản
- Ng âm tiêu bản vào dung dịch 2X SSC ở 37±1oC trong 15 phút.
- Rửa tiêu bản qua cóng chứa dung dịch 2X SSC ở nhiệt độ phò ng trong 5 phút.
- Chuyển tiêu bản qua cóng chứa dung dịch formaldehyde 10% ở nhiệt độ phò ng trong 5 phút.
- Rửa tiêu bản qua cóng chứa dung dịch 2X SSC ở nhiệt độ phò ng trong 5 phút.
- Chuyển tiêu bản qua cóng chứa c ồ n 700 trong 1 phút.
- Chuyển tiêu bản qua cóng chứa cồ n 850 trong 1 phút.
- Chuyển tiêu bản qua cóng chứa c ồ n 100° trong 1 phút.
- Để tiêu bản khô hoàn toàn ở nhiệt độ ph ng.
2.2. Chuẩn bị probe
- Trộn đều các dung dịch sau trong 1 ống PCR (1 ^l probe + 7 ^l LSI + 2 ^l dH2O) /ltiêu bản
- Ly tâm nhẹ.
2.3. Lai
- Nhỏ 10 ul dung dịch probe vào khu vực đánh dấu trên tiêu bản sau đó che phủ bằng coverslip.
Yêu cầu: dung dịch probe thấm đều trên tiêu bản, không có bọt khí.
- Phủ kín coverslip bằng cao su xi măng.
- Đặt tiêu bản vào máy lai, chọn chương trình biến tính ở 73 oC trong 3 phút và ủ 37oC trong 16 - 20 giờ.
2.4. Rửa sau khi lai
- Gỡ b ỏ xi măng cao su và coverslip.
- Ngâm và lắc mạnh tiêu bản lần lượt qua các cóng Coplin sau:
+ Dung dịch (0,4X SSC/ 0,3% NP40): 2 phút, 73oC.
+ Dung dịch (2X SSC/ 0,1% NP40): lphút, nhiệt độ phòng.
- Làm khô tiêu bản.
3. Nhuộm kháng thể tương bào
- Chuẩn bị 20 ul kháng kháng thể Kappa và Lambda/ tiêu bản (2 ul AMCA AntiHuman Kappa: 2 ul AMCA Anti-Human Lambda : 16 ul PBS 1X).
- Nhỏ 20 ul kháng kháng thể Kappa và Lambda lên bề mặt tiêu bản. Phủ kín tiêu bản bằng coverslip. Ủ trong tối ở 37oC tối thiểu 20 phút.
- Rửa qua 2 cóng chứa PBS 1X trong 2 phút mỗi cóng.
- Để tiêu bản khô hoàn toàn ở nhiệt độ phòng.
- Chuẩn bị 20 ul kháng kháng thể Ig (H+L)/ tiêu bản (1 ul AMCA Anti-Goat Ig (H+L): 19 ul PBS 1X).
- Nhỏ 20 ^l kháng kháng thể Ig (H+L) lên bề mặt tiêu bản. Phủ kín tiêu bản bằng coverslip. Ủ trong tối ở 37oC tối thiểu 20 phút.
- Rửa qua 2 cóng chứa PBS 1X trong 2 phút mỗi cóng.
- Để tiêu bản khô hoàn toàn ở nhiệt độ phòng.
4. Phân tích kết quả
- Nhỏ 10-20 pl dung dịch antifade lên bề mặt tiêu bản để chống mất màu probe và ổn định tín hiệu DAPI trên tương bào.
- Phủ kín tiêu bản bằng coverslip.
Yêu cầu: dung dịch dàn đều trên tiêu bản và không có bọt khí.
- Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang với màng lọc thích hợp.
- Quy tắc phân tích theo hướng dẫn cụ thể của nhà sản xuất cho từng loại probe. Thông thường sẽ tiến hành phân tích 100 tương bào để đưa ra kết quả cuối cùng.

VI. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

​

​

TÀI LIỆU THAM KHẢO​

1. Tài liệu hướng dẫn sử dụng của công ty Vysis.
2. Lynda J. Cambell (2011). “Detection of Chromosome Abnormalities using cytoplasmic Immunoglobulin staining and FISH in Myeloma”. Cancer Cytogenetics: Methods and Protocols, Human Press, p. 159-172.
Filkova H. Et al (2006). “Protocol for the identification of malignant plasma cells in bone marrow samples using simultaneous staining of cytoplasmic immunoglobulin with FISH (cIg FISH)”. Detection of chromosomal aberrations in multiple myeloma. Masaryk University Press, p. 15-18.

Nguồn: Quyết định 3336/QĐ-BYT ngày 20/7/2017 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc ban hành tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật Huyết học - Truyền máu - Miễn dịch - Di truyền - Sinh học phân tử.