Thảo luận [SOPs] PHÂN TÍCH DẤU ẤN/CD/MARKER MIỄN DỊCH MÁU NGOẠI VI, HOẶC DỊCH KHÁC

PHÂN TÍCH DẤU ẤN/CD/MARKER MIỄN DỊCH MÁU NGOẠI VI, HOẶC DỊCH KHÁC BẰNG KỸ THUẬT FLOW CYTOMETRY (LÀM CHO 1 DẤU ẤN/CD/MARKER)
(Blood or other fluid Immunophenotyping by flow cytometry)​

​

I. NGUYÊN LÝ
- Cùng với sự phát triển của tế bào tạo máu, các quần thể tế bào máu thuộc từng dòng khác nhau và các lứa tuổi khác nhau mang những đặc điểm dấu ấn miễn dịch (c òn gọi là các marker hay các CD) khác nhau. Ví dụ CD45 là kháng nguyên bạch cầu chung, có trên bề mặt tất cả các tế bào bạch cầu trưởng thành. Ở giai đoạn non, bạch cầu có thể dương tính yếu hoặc âm tính với CD45. Các dấu ấn miễn dịch non khác như CD34, HLA-DR, TdT gặp ở những tế bào non. Các dấu ấn đặc trưng cho dò ng tủy chung có CD13, CD33, CD15, CD117, MPO...; cho dò ng mono có thêm CD14, CD16; cho dòng hồng cầu có thêm CD123a, CD71; cho dòng tiểu cầu có thêm CD41, CD61. Các dấu ấn miễn dịch đặc trưng cho dòng lympho B có CD10, CD19, CD20, CD22...; cho dò ng lympho T có CD2, CD3, CD5, CD7, CD4, CD3, CD8....
- Trên phân tích tế bào dòng chảy, tế bào máu ngoại vi ủ với anti CD45 sau ly giải hồng cầu sẽ phân bổ trên đồ thị SS vs CD45 thành 3 vùng quần thể rõ rệt: vùng bạch cầu hạt, vùng mono, và vùng lympho.
- Các quần thể tế bào blast ác tính thường xuất hiện trong vùng cửa sổ blast (trên đồ thị SS vs CD45), và/hoặc có các đặc điểm không đồng bộ về kháng nguyên (xuất hiện đ ng thời các kháng nguyên thuộc đặc trưng các d ng tế bào khác nhau, xuất hiện đồng thời các kháng nguyên thuộc các giai đoạn phát triển khác nhau của cùng 1 dòng tế bào), xuất hiện kháng nguyên quá mức, giảm hoặc mất biểu hiện một kháng nguyên nào đó. Trong quá trình biệt hóa, các tế bào máu có sự xuất hiện hoặc là mất đi các dấu ấn miễn dịch. Mỗi một dò ng tế bào, một giai đoạn tế bào sẽ có những dấu ấn miễn dịch đặc trưng. Vì vây, có thể căn cứ vào sự có mặt hoặc không có mặt các dấu ấn miễn dịch có thể xác định được dòng tế bào và giai đoạn biệt hóa của tế bào ung thư trong Lơ xê mi cấp.
- Bằng cách sử dụng các kháng thể đơn dòng chống lại các dấu ấn miễn dịch đặc hiệu và phân tích trên máy Flow cytometry có thể phân tích được kiểu hình miễn dịch của một loại tế bào nào đó, xác định được tế bào ung thư máu thuộc d ng nào và giai đoạn biệt hóa nào.

II. CHỈ ĐỊNH
- Lơ xê mi cấp (nếu không lấy được tủy xương).
- Lơ xê mi kinh (nếu không lấy được tủy xương).
- Đa u tủy xương (nếu không lấy được tủy xương).
- Rối loạn sinh tủy (nếu không lấy được tủy xương).
- Rối loạn tăng sinh dò ng lympho.
- Suy giảm miễn dịch bẩm sinh.
- Suy giảm miễn dịch thứ phát (sau nhiễm HIV, sau điều trị hóa chất, sau nhiễm trùng nặng...).
- Nghi ngờ khối u thâm nhiễm thần kinh trung ương, khoang màng phổi, khoang màng bụng.

III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.

IV. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo: thực hiện kỹ thuật.
- Bác sỹ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.

2. Phương tiện, hóa chất
2.1. Phương tiện
- Máy phân tích tế bào d ò ng chảy (máy flow cytometer);
- Máy ly tâm;
- Máy lắc trộn;
- Pipet man và đầu pipet loại 250 ul và 1.000 ul;
- Ông nghiệm flow cytometry (chuyên dụng cho máy phân tích tế bào dòng chảy).

2.2. Hóa chất chính
- Anti CD45-PC5 (có thể sử dụng màu huỳnh quang khác như PerPC5.5, APC, ECD...).
- kháng thể kháng 1 CD định khảo sát có gắn mầu huỳnh quang khác với màu huỳnh quang của kháng thể anti CD45 (ví dụ CD33-PE).
- Dung dịch ly giải hồng cầu.
- Dung dịch sheath chạy máy flow.
- Dung dịch đệm PBS.

2.3. Hóa chất, vật tư khác
Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite, găng tay.

3. Bệnh phẩm
- Là mẫu máu ngoại vi chống đông bằng EDTA hoặc mẫu dịch chọc hút (màng phổi, màng bụng, dịch khớp...). Mẫu được lấy từ các người bệnh nghi ngờ lơ xê mi cấp hoặc các bệnh lý huyết học lành tính và ác tính khác. Tuy nhiên trong một số trường hợp nhất định có thể lấy mẫu từ các người bệnh có tình trạng bệnh lý khác (nhiễm trùng, nhiễm HIV, suy giảm miễn dịch.) tùy thuộc vào mục đích khảo sát của bác sỹ lâm sàng.

V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
- 2ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA.
- Mẫu cần được ủ kháng thể ngay trong vòng 6 giờ sau lấy mẫu.

2. Tiến hành kỹ thuật
2.1. Chuẩn bị mẫu
- Đếm số lượng bạch cầu có trong mẫu, điều chỉnh số lượng bạc cầu về 1 x 106 tế bào/ml.
- Lấy 100 pl máu đã điều chỉnh số lượng tế bào cho vào 1 ống nghiệm flow cytometry.
- Ly giải h ng cầu bằng 1 ml dung dịch ly giải h ng cầu, ủ nhiệt độ ph ng trong 10 phút.
- Ly tâm rửa huyền dịch tế bào sau ly giải hồng cầu 2 lần, mỗi lần làm như sau: thêm 3 ml dung dịch PBS vào ống flow cytometry, trộn lắc đều và ly tâm 2000 vòng/phút trong 3 phút. Đổ bỏ dịch nổi, để lại cặn tế bào và lượng dịch còn lại (khoảng 100 ul). Trộn đều cặn và lượng dịch còn lại.
2.2. Ủ kháng thể
- Cho kháng thể anti CD45-PC5, kháng thể kháng dấu ấn miễn dịch cần khảo sát (ví dụ CD33-PE) (mỗi loại 20 ul) vào ống flow cytometry chứa cặn tế bào đã phá hồng cầu ở bước trên. Trộn đều và ủ nhiệt độ phòng 20 phút, tránh ánh sáng.
- Rửa b ỏ kháng thể thừa: sau ủ, thêm 3 ml dung dịch PBS vào ống flow cytometry, trộn đều và ly tâm 2.000 vò ng/phút trong 3 phút. Đổ bỏ dịch nổi, để lại cặn tế bào.
- Thêm 1 ml PBS vào ống cặn tế bào, trộn đều. Lúc này ống đã sẵn sàng cho phân tích.
2.3. Phân tích trên máy flow cytometry
- Đưa ống flow cytometry vào vị trí đọc trên máy.
- Mở chương trình phân tích dấu ấn miễn dịch đa màu đã lập sẵn trên máy. Nhập vị trí ống phân tích và chạy chương trình phần mềm phân tích.

VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Quy ước: với mỗi một CD nếu tỷ lệ dương tính trên 20% thì được gọi là dương tính với CD đó.
- Khi phân tích chủ yếu tập trung phân tích quần thể tế bào blast(nếu có). Trong một số trường hợp cụ thể (không phải bệnh máu ác tính), cần phân tích thêm các quần thể bạch cầu hạt, lympho, mono.
- Nếu quần thể blast dương tính với các dấu ấn dò ng tủy như CD13, CD33... thì chẩn đoán là ung thư dòng tủy. Nếu dương tính với CD2, CD3, CD7, CD4, CD8... thì chẩn đoán là ung thư dòng lympho T. Nếu dương tính với các dấu ấn dòng lympho B như CD19, CD20CD22, CD79a... thì chẩn đoán là ung thư dòng lympho B. Nếu chỉ dương tính với CD34 thì chẩn đoán là ung thư tế bào gốc tạo máu chưa phân thể.
- Nếu không phải mẫu của người bệnh ung thư máu, tùy theo ý định của bác sỹ điều trị sẽ phân tích tỷ lệ % hoặc số lượng tuyệt đối (số tế bào/microlit) tế bào có mang một đặc điểm miễn dịch nhất định.

VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên người bệnh trên giấy x ét nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.
Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu bị đông hoặc đã để quá l âu thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.

- Các tế bào bạch cầu nằm không đúng vùng tế bào trong cửa sổ chương trình chạy (Phải căn cứ vào đồ thị SS và CD45, căn cứ vào sự phân bổ rõ rệt của các quần thể tế bào trên đồ thị này và căn cứ vào quần thể tế bào lympho bình thường để xác định mức độ chồng lấp màu. Ở một mẫu máu b ình thường, quần thể tế bào phân định thành 3 vùng rõ rệt là vùng bạch cầu hạt, vùng lympho và vùng mono). Nguyên nhân có thể do th c hiện không đúng, lượng kháng thể ủ không đủ, th c hiện không đủ các bước của quy trình, ủ không đủ thời gian, hút pipet không tốt, tắc kim hút trên máy...
Xử trí: Làm lại x ét nghiệm và tuân thủ theo đúng quy trình. Kiểm tra máy trước khi phân tích, phải rửa máy, đuổi bọt khí và thông kim hút (nếu cần) theo hướng dẫn đi theo máy.

TÀI LIỆU THAM KHẢO​

1. Beckman Coulter. 2011. IOTest CD45-PC5 Used manual.
2. Beckman Coulter. 2011. IOTest CD3-PE Used manual.
3. Beckman Coulter. 2011. IOTest CD33-FITC Used manual.
4. Beckman Coulter. 2011. IOTest CD34-PE Used manual.
5. Beckman Coulter. 2011. IOTest CD10-FITC Used manual.
6. Beckman Coulter. 2011. IOTest CD117-PE Used manual.
J J M Van Dongen, L Lhermitte, S Bottcher, J Almeida, V H J van der Velden, J Flores-Montero et al. 2012. EuroFlow antibody panels for standardized n- dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26, 1908-1975.

Nguồn: Quyết định 3336/QĐ-BYT ngày 20/7/2017 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc ban hành tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật Huyết học - Truyền máu - Miễn dịch - Di truyền - Sinh học phân tử.​