Thảo luận [SOPs] Phản ứng hòa hợp tiểu cầu - Kỹ thuật pha rắn

PHẢN ỨNG HÒA HỢP TIỂU CẦU
(Kỹ thuật pha rắn)​

​

I. NGUYÊN LÝ
Tiểu cầu của người cho được gắn vào bề mặt của giếng polystyrene microplate. Huyết thanh/ huyết tương của người bệnh được thêm vào giếng và ủ với tiểu cầu của người cho, nếu trong huyết thanh của người bệnh có kháng thể kháng tiểu cầu thì các kháng thể này sẽ gắn với tiểu cầu của người cho. Các globulin miễn dịch không gắn lên tiểu cầu có trong giếng sẽ được rửa sạch, sau đó thêm vào giếng dung dịch hồng cầu chỉ thị đã cảm nhiễm với anti-IgG. Ly tâm để các hồng cầu chỉ thị tiếp xúc được với các kháng thể kháng tiểu cầu có trong huyết thanh người bệnh đã được gắn với các tiểu cầu của người cho. Trong trường hợp người bệnh có kháng thể kháng tiểu cầu, phức hợp kháng nguyên, kháng thể kháng tiểu cầu và hồng cầu đã được gắn với anti-IgG (Hồng cầu chỉ thị) đã được hình thành ở trên sẽ ngăn cản sự di chuyển của các hồng cầu chỉ thị xuống đáy giếng khi được ly tâm, do vậy các hồng cầu chỉ thị sẽ bao phủ lên toàn bộ bề mặt giếng. Ngược lại trong trường hợp xét nghiệm âm tính, các hồng cầu chỉ thị sẽ không bị cản trở trong quá trình di chuyển, theo lực ly tâm sẽ lắng chặt xuống đáy giếng [1].

II. CHỈ ĐỊNH
- Người bệnh có chỉ định truyền khối tiểu cầu được tách từ hệ thống máy tách tế bào tự động của một người hiến tiểu cầu;
- Người bệnh có chỉ định truyền khối tiểu cầu pool;
- Người bệnh truyền tiểu cầu không hiệu lực;
- Người bệnh ghép tế bào gốc.

III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.

IV. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
Bác sỹ, cử nhân, kỹ thuật viên, điều dưỡng trung học.

2. Phương tiện:
2.1. Trang thiết bị, dụng cụ, vật tư tiêu hao
- Máy ly tâm phiến microplate 96 giếng;
- Máy ủ khô 37°C;
- Máy rửa bán tự động Immucor CSW 100 được thiết kế để sử dụng với Capture-P [2];
- Pipetman; pipet nhựa; máy ly tâm ống nghiệm; đồng hồ hẹn giờ; bút marker..
- Tấm chiếu sáng;
- Ống nghiệm polypropylene hoặc polyethylene.
2.2.Thuốc thử và hoá chất
- Capture-P Test Wells ở trong túi kín;
- Capture LISS trong lọ nhỏ giọt;
- Capture-P Indicator Red Cells trong lọ nhỏ giọt;
- Capture-P Positive Control Serum (Weak) trong lọ nhỏ giọt;
- Capture-P Negative Control Serum trong lọ nhỏ giọt;
- Dung dịch đệm phosphate, pH 6.5-7.5.
2.3. Mẫu bệnh phẩm
- 1 ống máu tĩnh mạch được chống đông bằng EDTA: 2 ml hoặc 1 ống không chống đông: 5 ml của người bệnh.
- Đơn vị tiểu cầu của người cho.
3. Thời gian làm xét nghiệm: 120 phút.

V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Chuẩn bị dụng cụ, hoá chất, sinh phẩm, trang thiết bị trước khi làm xét nghiệm.

2. Nhận mẫu máu và phiếu chỉ định xét nghiệm, kiểm tra và đối chiếu các thông tin trên mẫu máu với phiếu chỉ định xét nghiệm. Kiểm tra về số lượng và chất lượng mẫu máu.

3. Tiến hành xét nghiệm
- Mang các hóa chất, sinh phẩm về nhiệt độ phòng 15 phút trước khi làm xét nghiệm;
- Chuẩn bị mẫu tiểu cầu làm xét nghiệm như sau:
+ Chuẩn bị 1 ống nghiệm polypropylene hoặc polyethylene sạch, khô, ghi mã của đơn vị khối tiểu cầu lên ống nghiệm.
+ Lấy 1 đoạn dây từ túi tiểu cầu của người hiến và cắt dây tiểu cầu vào ống nghiệm nhựa đã chuẩn bị ở trên.
- Lấy số lượng giếng Capture-P cần thiết để làm xét nghiệm từ túi bảo vệ;
- Dùng pipet nhựa hút 1-2 giọt (tương đương 50-100 pl) tiểu cầu của người cho nhỏ vào 3 giếng đầu tiên của hàng. Một giếng là chứng dương (yếu) và giếng thứ hai là chứng âm, giếng thứ ba là giếng làm xét nghiệm hòa hợp giữa tiểu cầu của người cho và huyết thanh/ huyết tương của người bệnh;
- Ly tâm phiến với tốc độ 45-65 nhân với g (g là lực ly tâm của máy ly tâm) trong vòng 5 phút;
- Rửa tiểu cầu trong các giếng bằng máy rửa bán tự động Immucor CSW 100 để loại bỏ tiểu cầu và huyết tương thừa. Kiểm tra các giếng sau khi rửa để xem có tiểu cầu gắn trên đáy giếng không. Nếu tiểu cầu đã được cố định lên đáy giếng, đáy giếng sẽ xuất hiện một lớp tiểu cầu mỏng giống như mây và không còn có dịch thừa. Nếu còn dịch thừa ở đáy giếng thì cần rửa lại [2];
Lưu ý: Kỹ thuật rửa quá nhiều hoặc mạnh có thể đánh bật hoặc tạo ra các l ỗ hổng trong các lớp tiểu cầu đã gắn
- Thêm 2 giọt Capture LISS vào mỗi giếng ngay sau khi rửa;
Lưu ý: Các giếng sau khi rửa để lâu hơn 1 phút mà không nhỏ thêm capture LISS sẽ khô và dẫn đến phá vỡ các lớp tế bào tiểu cầu.
- Thêm 1 giọt Capture-P Positive Control Serum (Weak) vào giếng đầu tiên của hàng;
- Thêm 1 giọt Capture-P Negative Control Serum vào giếng thứ hai của
hàng;
- Thêm 1 giọt huyết tương hoặc huyết thanh của người bệnh vào giếng thứ ba của hàng;
- Chạm nhẹ nhàng liên tục vào cạnh của phiến để trộn huyết thanh/ huyết tương của người bệnh với dung dịch Capture LISS;
Lưu ý: Màu tím của Capture Liss sẽ chuyển thành màu xanh da trời hoặc màu ngọc lam khi có mặt của huyết thanh/ huyết tương người bệnh;
- Ủ các phiến ở 36-38°C trong vòng 30-60 phút;
- Rửa tiểu cầu trong các giếng bằng máy rửa chuyên dụng;
- Thêm 1 giọt hồng cầu chỉ thị Capture-P vào mỗ i giếng ngay sau khi rửa;
- Ly tâm phiến với tốc độ 700-900 x g (g là lực ly tâm của máy ly tâm) trong vòng 1 phút;
- Đặt phiến trên một mặt phẳng được chiếu sáng, so sánh kết quả của giếng xét nghiệm với chứng dương, chứng âm. Xét nghiệm phản ứng hòa hợp tiểu cầu âm tính khi giếng xét nghiệm và chứng âm cho kết quả âm tính. Xét nghiệm phản ứng hòa hợp tiểu cầu dương tính khi giếng xét nghiệm và chứng dương cho kết quả dương tính.

VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Phản ứng ngưng kết: Các hồng cầu chỉ thị sẽ bao phủ lên toàn bộ bề mặt giếng, kết luận phản ứng hòa hợp tiểu cầu dương tính, chọn đơn vị tiểu cầu khác và làm lại phản ứng hòa hợp tiểu cầu cho người bệnh;
- Phản ứng không ngưng kết: Các hồng cầu chỉ thị lắng chặt xuống đáy giếng, kết luận phản ứng hòa hợp tiểu cầu âm tính, phát đơn vị tiểu cầu để truyền cho người bệnh.
Những điểm cần chú ý khi làm xét nghiêm:
1. Đọc kỹ các bước của quy trình hướng dẫn trước khi tiến hành kỹ thuật;
2. Tuân thủ đúng các hướng dẫn sử dụng sinh phẩm của nhà sản xuất sinh phẩm;

VII. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Capture-P - Solid Phase System for the Detection of IgG Antibodies to Platelets, Immuco Gamma.
2. Hướng dẫn sử dụng máy rửa Immucor CSW 100.