Thảo luận [SOPs] ĐỊNH LƯỢNG IL-2R (HAY CD25 HÒA TAN) TRONG HUYẾT THANH

ĐỊNH LƯỢNG IL-2R (HAY CD25 HÒA TAN) TRONG HUYẾT THANH
BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH GẮN MEN (ELISA)
(IL-2R quantitative test by ELISA)
​

I. NGUYÊN LÝ
Kháng thể (KT) kháng IL-2R người được hấp phụ vào giếng xét nghiêm. Khi thêm huyết thanh người bệnh vào giếng xét nghiệm, IL-2R trong huyết thanh người bệnh được gắn đặc hiệu lên các KT này trong giếng, tạo nên phức hợp KN - KT. Kháng thể kháng IL-2R người kết hợp với HRP (có enzyme peroxidase) được thêm vào ở bước tiếp theo sẽ gắn tiếp tục lên IL-2R trong mẫu huyết thanh. Sau khi ủ và rửa, các kháng thể thừa được loại bỏ. Dung dịch cơ chất được thêm vào giếng, phản ứng với HRP tạo màu. Sản phẩm màu được tạo ra tương ứng với lượng IL-2 có mặt trong mẫu huyết thanh. Phản ứng kết thúc khi thêm dung dịch dừng phản ứng (có chứa acid). Đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 450 nm. Một đường cong chuẩn được hình thành từ 7 mẫu IL-2R chuẩn (đã biết nồng độ) được pha loãng. Đường chuẩn này được thiết lập với mỗi phiến xét nghiệm. Nồng độ IL-2R của mẫu huyết thanh được xác định dựa trên đường chuẩn này.

II. CHỈ ĐỊNH
Các trường hợp có sự gia tăng hoạt tính của tế bào lympho T: Hội chứng thực bào tế bào máu, Lơ xê mi tế bào tóc, U lympho Hodgkin, không Hodgkin; các bệnh tự miễn hoặc nhiễm khuẩn như bệnh Kawasaki, Xơ cứng bì rải rác, bệnh Lupus ban đỏ hệ thống; bệnh lý thải ghép,...

III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.

IV. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện :
- Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;
- Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.

2. Phương tiện - Hóa chất
2.1. Phương tiện
- Máy ly t m ống máu;
- Pipet và đầu pipet loại 25ul và 1000ul;
- Dàn máy ELISA (tự động hoặc bán tự động);
- Găng tay.
2.2. Hóa chất
Kít định lượng IL-2R gồm các thành phần sau:
- Phiến xét nghiệm 96 giếng có phủ KT đơn dòng kháng IL-2R người (Coated Microwell Strips): phiến được đựng trong túi bạc.
- Dung dịch cộng hợp- Kháng thể đơn dòng kháng IL-2R người kết hợp HRP (HRP conjugate): lọ 70ul, nắp vàng.
- IL-2R người đông khô, sau tái hò a tan đạt nồng độ 40ng/ml (sIL-2R Standard): 2 lọ 250ul, nắp màu xanh.
- Dung dịch pha loãng mẫu (Sample Diluent): lọ 12ml, nắp màu đen.
- Dung dịch đệm 20x, chứa dung dịch PBS 1% -20% và 10% BSA (Assay Buffer Concentrate 20x): lọ 5ml, nắp trắng.
- Dung dịch đệm rửa 20x, chứa PBS 1%-20% (Wash buffer concentrate 20x): lọ 50ml, nắp đen.
- Dung dịch cơ chất tetramethyl-benzidin (Substrate Solution): lọ 15ml, nắp xanh.
- Dung dịch dừng phản ứng, chứa dung dịch acid phosphoric 1M (Stop solution): lọ 15ml, nắp vàng.
- Miếng dán (Adhesive Films): gồ m 2 miếng dán được đóng gói trong bao nilon; Hóa chất khác: Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.

3. Mẫu bệnh phẩm
- Mẫu dùng là huyết thanh.
- Cần tách huyết thanh càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản ứng.
- Nếu có lẫn hồng cầu hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh th cần ly t m mẫu để loại b các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
- Mẫu huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ 2oC đến 8oC có thể dùng làm xét nghiệm trong vòng 7 ngày. Nếu muốn để lâu hơn mới xét nghiệm cần phải bảo quản ở tủ lạnh s âu (< -20oC). Tuy nhiên với mẫu bảo quản lạnh sâu cần tránh đông-tan nhiều lần.

V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Chuẩn bị giếng: rửa phiến 2 lần với 400ul dung dịch đệm rửa, cách nhau 10 - 15 giây.
2. Pha dung dịch pha loãng 20X (sample buffer) thành dung dịch 1X. VD 20ml dung dịch 1X (1ml dung dịch 20X + 19ml nước cất H2O).
3. Pha IL-2R người đông khô về đúng nồ ng độ 40ng/ml.
4. Nhỏ 100ul dung dịch pha loãng mẫu vào các giếng chuẩn. Nhỏ 50ul dung dịch pha loãng mẫu vào giếng xét nghiệm.Nhỏ 50ul huyết thanh vào giếng xét nghiệm.
5. Thêm 50ul dung dịch cộng hợp.
6. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
7. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 400^l /giếng/lần.
8. Nhỏ 100ul cơ chất tạo mầu (TMB subtrate) vào mỗi giếng.
9. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phò ng, tránh ánh sáng.
10. Nhỏ 100ul dung dịch dừng phản ứng (stop solution) vào mỗi giếng theo đúng trình tự nhỏ TMB.
11. Đọc phiến ở bước sóng 450/620 nm (tốt hơn thì dùng bước sóng kép 450/ 620 nm) trong vòng 30 phút sau khi ủ dung dịch ngừng phản ứng.
12. Phân tích kết quả.

VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Căn cứ vào nồng độ chuẩn được xác định khi thực hiện xét nghiệm với 7 mẫu IL-2R đã được chuẩn bị, thiết lập đường cong chuẩn.

​

- Giá trị biện luận: Dựa trên đường cong chuẩn được thiết l ập, tính toán giá trị IL-2R của mẫu huyết thanh.
Giá trị IL-2R > 2400U/1 có ý nghĩa trong việc chẩn đoán xác định hội chứng thực bào tế bào máu.

VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên người bệnh trên giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất, máu bị đông.
Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại thông tin trên giấy chỉ định và trên ống nghiệm, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.

- Sai sót do nhỏ mẫu vào phiến phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự người bệnh và thứ tự mẫu phân tích.
Xử trí: Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi nhỏ mẫu.

- Chứng dương âm tính hoặc chứng âm dương tính: Nếu xảy ra hiện tượng này đều không dùng được kết quả của lần xét nghiệm này. Nguyên nhân có thể do hóa chất không đảm bảo chất lượng, do không thực hiện đủ và đúng các bước trong quy trình xét nghiệm, nhiệt độ phản ứng không phù hợp, thực hiện bước rửa kém hiệu quả.
Xử trí: làm lại xét nghiệm, kiểm tra chỉ dùng hóa chất còn hạn sử dụng và được bảo quản đúng điều kiện theo hướng đãn của nhà sản xuất, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng xét nghiệm (25-30oC).

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Abnova Diagnostics. ABNOVA instruction manual.