Thảo luận [SOPs] ĐỊNH DANH KHÁNG THỂ ANTI-HLA BẰNG KỸ THUẬT ELISA

ĐỊNH DANH KHÁNG THỂ ANTI-HLA BẰNG KỸ THUẬT ELISA
(Anti-HLA antibodies identification by ELISA Technique)​

I. NGUYÊN LÝ
Dựa trên nguyên lý kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, dùng kháng nguyên đã biết để tìm kháng thể chưa biết. Ủ kháng nguyên với kháng thể của người bệnh, sau đó ủ với kháng kháng thể gắn enzyme và chất màu phù hợp. Do enzyme thủy phân chất màu nên khi đọc trên máy quang phổ kế, vị trí nào có sự biến đổi chất màu thì tương ứng có phản ứng kháng nguyên -kháng thể và đọc được tên kháng thể tương ứng.
Nguồn gốc quy trình: theo quy trình kỹ thuật của hãng.

II. CHỈ ĐỊNH
Người bệnh ghép tế bào gốc đồng loại, ghép cơ quan;

III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Người bệnh ghép tế bào gốc tự thân.

IV. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện
Cán bộ được đào tạo để thực hiện kỹ thuật.

2. Phương tiện-Hóa chất
2.1. Phương tiện:
- Hệ thống ELISA;
- Máy tính và phần mềm phân tích kết quả;
- Micro pipet, đầu côn lọc, ống nghiệm 1,5 ml, hốt vô trùng;
- Găng tay, mũ, khẩu trang.
2.2. Hóa chất:
- Bộ kít xét nghiệm gồm: phiến chạy mẫu gắn kháng nguyên, kháng kháng thể gắn enzyme; chất màu (enzyme A, enzyme B), dung dịch dừng phản ứng (stop reagent), huyết thanh chứng.
- Dung dịch đệm rửa (Wash buffer).
- Dung dịch pha loãng.

3. Mẫu bệnh phẩm
Mẫu máu không chống đông.

V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Chuẩn bị mẫu
- Ly tâm ống mẫu 3.000v/p trong 10 phút.
- Hút 1ml huyết thanh/huyết tương vào ống eppendorf 1,5 ml.

2. Ủ mẫu với kháng nguyên
- Pha dung dịch huyết thanh chứng (10X) với dung dịch pha loãng để được dung dịch chứng 1X.
- Pha loãng 125µl huyết thanh người bệnh với 375µl dung dịch pha loãng.
- Chuyển 10µl huyết thanh người bệnh đã pha cho vào giếng chạy máy.
- Chuyển 10µl huyết thanh chứng 1X vào vị trí giếng quy định.
- Đậy nắp phiến và ủ ở 20-25oC trong 1giờ.

3. Rửa mẫu
- Vẩy mạnh phiến để loại bỏ dịch nổi.
- Thấm dịch bằng cách úp ngược nhanh phiến vào giấy thấm.
- Thêm 15-20µl đệm rửa 1X vào mỗi giếng, xoay nhẹ; vẩy phiến, thấm dịch.
- Lặp lại bước rửa 2 lần.

4. Ủ mẫu với kháng kháng thể gắn enzyme
- Pha dung dịch kháng kháng thể gắn enzyme 100X về 1X;
- Thêm 10µl dung dịch đã pha vào mỗi giếng;
- Đậy nắp phiến và ủ ở 20-25oC trong 40 phút;
- Loại bỏ dịch nổi giống như bước rửa mẫu, rửa 4 lần.

5. Ủ mẫu với chất màu
- Pha 500µl enzyme A và 500µl enzyme B;
- Thêm 10µl chất màu vào mỗi giếng;
- Đậy nắp phiến, ủ ở nhiệt độ 37oC/10-15 phút, điều kiện tối.
- Thêm 5µl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng, đậy nắp và ủ 15 phút.

6. Chạy mẫu
- Chạy kết quả trong vòng 1 giờ với đầu đọc ELISA;
- Phân tích kết quả trên phần mềm.

7. Đọc và trả kết quả xét nghiệm
- Đọc kết quả;
- Ghi kết quả vào phiếu xét nghiệm;
- Ký duyệt và trả kết quả cho bộ phận chỉ định.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. One Lambda (2013). Lambda antigen tray for ELISA.
2. Wang. G, Tarsitani. C (1998). A new micro-Elisa for anti-Class I and Class II antibody detection. Human Immunol. 59 (1): 133.