Thảo luận [SOPs] Đánh giá tỷ lệ sống của tế bào bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy

ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ SỐNG CỦA TẾ BÀO
BẰNG KỸ THUẬT TẾ BÀO DÒNG CHẢY
(Assessment of cellular viability by flow cytometry)​

I. NGUYÊN LÝ
Dựa trên nguyên lý kết hợp đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể, sử dùng kháng thể đơn dòng kháng CD45 và chất màu huỳnh quang để phát hiện các tế bào tạo máu. Dùng thuốc thử đặc hiệu (7-AAD) để phân biệt tế bào sống và tế bào chết (những tế bào chết sẽ bắt màu thuốc nhuộm) băng hệ thống đếm tế bào dòng chảy. Qua đó có thể tính tỷ lệ tế bào sống trên một quần thể.
Nguồn gốc quy trình: theo quy trình kỹ thuật của hãng, theo AABB (American Association of Blood Bank).

II. CHỈ ĐỊNH
Tất cả các loại mẫu tế bào tạo máu cần xác định tỷ lệ tế bào sống (tế bào gốc trước, sau xử lý, bảo quản…);

III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Tế bào gốc không thuộc hệ tạo máu.

IV. THUẬT NGỮ SỬ DỤNG
- 7-AAD (7-aminoactinomycin D): có ái lực mạnh với DNA, đi vào tế bào khi màng tế bào tổn thương hay tế bào chết.
- CD45: Dấu ấn đặc hiệu của tế bào tạo máu.

V. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện
Cán bộ được đào tạo để thực hiện kỹ thuật.

2. Phương tiện - Hóa chất
2.1. Phương tiện
- Hệ thống Flow cytometry;
- Máy trộn mẫu vortex;
- Máy tính và phần mềm phân tích kết quả;
- Micro pipet, đầu côn, ống nghiệm;
- Găng tay, mũ, khẩu trang.

2.2. Hóa chất
- Bộ kít xét nghiệm gồm kháng thể kháng CD45, 7-AAD;
- Dung dịch phá hồng cầu NH4Cl 1X;
- Dung dịch PBS 1X.

3. Mẫu bệnh phẩm
Mẫu tế bào gốc hoặc máu có chống đông EDTA.

VI. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1. Chuẩn bị mẫu và hóa chất
- Chuẩn bị bộ kit xét nghiệm gồm các kháng thể kháng CD45, 7-AAD;.
- Đếm số lượng bạch cầu của mẫu;
- Dùng dung dịch PBS 1X pha loãng mẫu sao cho số lượng bạch cầu còn khoảng 10-15 G/l;

2. Ủ mẫu với kháng thể
- Hút 100µl mẫu đã pha loãng vào ống nghiệm chạy máy;
- Thêm 20µl kháng thể kháng CD45 (gắn huỳnh quang) vào ống;
- Thêm 20µl 7-AAD vào ống;
- Ủ hỗn hợp trong 20 phút, điều kiện tối, nhiệt độ phòng;

3. Phá hồng cầu
- Dùng nước cất và hóa chất Lysing 10X để pha 2ml dung dịch Lysing 1X;
- Thêm 2ml dung dịch Lysing 1X đã pha vào hỗn hợp đã ủ trong ống nghiệm;
- Tiếp tục ủ trong 10 phút, điều kiện tối ở nhiệt độ phòng;

4. Chạy mẫu trên máy Flow
- Mở máy, chọn chương trình chạy phù hợp, nhập các thông số cần thiết;
- Đưa lần lượt các ống nghiệm vào đúng vị trí trong máy;
- Chạy máy
.
5. Đọc kết quả
- Chọn quần thể dương tính với CD45 là quần thể tế bào tạo máu;
- Trên cửa sổ 7-AAD, xác định rõ quần thể tế bào âm tính với 7-AAD là quần thể tế bào sống, đọc tỷ lệ tế bào sống ở bảng kết quả.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nicholas Greco, Lynn O’Donnell (2009). Assessing Viability by measuring apoptotic cells using flow cytometry. AABB 2009 - Cellular therapy: principles, methods and regulation; Method 47-3, p.569-72.

2. Beckmann coulter (2004). Instruction for use Cytomic FC500 with CXP software.