Thảo luận [SOP] Neisseria gonorrhoreae Real-time PCR

​

Neisseria gonorrhoreae Real-time PCR​

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
1. Mục đích:
Xác định sự có mặt của Neisseria gonorrhoeae trong bệnh phẩm dịch niệu đạo, cổ tử cung hoặc dịch cơ thể có nghi ngờ có căn nguyên N. gonorrhoeae.

2. Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.

II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)
2.1. Trang thiết bị
- Tủ an toàn sinh học cấp 2
- Máy nhiệt
- Máy ly tâm > 12000 gpm/phút
- Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml
- Máy vortex
- Máy Real-time PCR
- Ống Eppendorf 1,5 ml ho c 2 ml
- Các loại Micropipette đi u chỉnh được: 1000µl, 200µl, 100µl, 10µl
- Đầu côn có màng lọc 10 μl, 100 μl, 200 μl và 1000 μl
- Tủ lạnh thường
- Tủ âm sâu (-20oC) hoặc (-70oC) (nếu có)

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Dụng cụ lấy bệnh phẩm

Khay đựng bệnh phẩm

Hộp vận chuyển bệnh phẩm

Găng không có bột (DNase-RNase free)

Ống nhựa Ependoff 1.5ml

Sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho chẩn đoán

Khấu hao sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng

Hóa chất và vật tư tiêu hao cho tách acid nucleic

Tube eppendorff 1,5 ml

Strip 8 tubes 0,1 ml

Nắp đậy strip 8 tubes

Đầu côn có phin lọc 1 ml

Đầu côn có phin lọc 200 ul

Đầu côn có phin lọc 10 ul

Giấy thấm không bụi

Giấy xét nghiệm

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Bút viết kính

Bút bi

Mũ

Khẩu trang

Găng tay xử lý dụng cụ

Quần áo bảo hộ

Dung dịch xà phòng rửa tay

Cồn sát trùng tay nhanh

Dung dịch khử trùng

Khăn lau tay

Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*

* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm
Dịch niệu đạo, cổ tử cung ho c dịch cơ thể có nghi ngờ có căn nguyên N.gonorrhoeae.

4. Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.

1. Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem phụ lục).

2. Tiến hành kỹ thuật: VD bộ sinh phẩm chẩn đoán LightPower CHT/NGN rPCR Plus (hoặc sinh phẩm tương đương)

2.1 Tách chiết DNA theo hướng dẫn sử dụng của Kit tách chiết DNA.

2.2 Thực hiện phản ứng Real-time PCR.

2.3 Đọc kết quả

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Bước 1: Kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm
- Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX
- Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu không bị ngoại nhiễm. Vì vậy có thể đọc kết quả mẫu chứng (+) và mẫu.
- Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu bị ngoại nhiễm, phải tiến hành tách chiết DNA lại.
Bước 2: Kiểm tra độ nhạy
- Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX
- Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu HEX: PCR không bị ức chế.
- Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại ho c tín hiệu thấp với kênh màu HEX, PCR bị ức chế toàn phần hay một phần, tách chiết DNA lại hoặc pha loãng DNA trước khi chạy PCR.

Bước 3: Xác định mẫu dương tính Neisseria gonorrhoeae
- Chọn từng mẫu , chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM
- Mẫu có tín hiệu huỳnh quang với kênh màu FAM và có Ct: là những mẫu dương tính Neisseria gonorrhoeae
- Các mẫu có Ct <12 và tín hiệu huỳnh quang không tăng theo chu kỳ nhiệt: pha loãng DNA mẫu với tỉ lệ 1/5 trước khi cho vào PCR master mix

Bước 4: Xác định mẫu âm tính Neisseria gonorrhoeae
- Chọn từng mẫu, chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Mẫu không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và dương tính với màu HEX, thì kết quả là mẫu âm tính với Neisseria gonorrhoeae

- Nếu mẫu có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM nhưng không có Ct và dương tính với màu HEX, thì kết quả là Neisseria gonorrhoeae trong bệnh phẩm dưới ngưỡng phát hiện

- Nếu mẫu không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và âm tính với màu HEX, thì mẫu bị ức chế cần tiến hành lại PCR với DNA đã pha loãng hoặc tách chiết lại. Nếu kết quả vẫn như cũ thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm.

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Phản ứng dương tính giả: do tạp nhiễm từ môi trường
- Phản ứng âm tính giả: do phản ứng PCR bị ức chế
- Để hạn chế các hiện tượng trên phải tuân thủ chặt chẽ quy trình kỹ thuật.

Nguồn: Quyết định số: 6769/QĐ-BYT - Về việc ban hành tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh