Vibrio cholerae real-time PCR I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ 1. Mục đích Xác định sự có mặt gen đặc trưng của Vibrio cholerae trong mẫu bệnh phẩm phân của người. 2.Nguyên lý Dựa trên nguyên lý của kỹ thuật Real-time PCR. II. CHUẨN BỊ 1. Người thực hiện - Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học). - Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học). 2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương) 2.1 Trang thiết bị - Tủ an toàn Sinh học cấp 2 - Máy Real-time PCR - Máy in màu - Máy ly tâm > 12000 gpm/phút - Máy nhiệt - Máy vortex - Pipette 2.2 Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm) Lọ lấy bệnh phẩm Panh Khay đựng bệnh phẩm Hộp vận chuyển bệnh phẩm Tube đựng bệnh phẩm Găng không có bột (DNase-RNase free) Sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho chẩn đoán Khấu hao sinh phẩm cho chẩn đoán và kiểm tra chất lượng Kit tách chiết DNA Ống Eppendorf 1,5 ml Ống Eppendorf 0,2 ml Đầu côn 10 ul có lọc Đầu côn 30 ul Đầu côn 200 ul có lọc Đầu côn 1 ml có lọc Ethanol BDH Water-DEPC Treated Giấy thấm Giấy xét nghiệm Sổ lưu kết quả xét nghiệm Bút viết kính Bút bi Mũ Khẩu trang Găng tay Găng tay xử lý dụng cụ Quần áo Dung dịch xà phòng rửa tay Cồn sát trùng tay nhanh Dung dịch khử trùng Khăn lau tay Ngoại kiểm (nếu có)* * Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm). 3 Bệnh phẩm Bệnh phẩm phân 4 Phiếu xét nghiệm Điền đầy đ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH 1. Lấy bệnh phẩm Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh. 2. Tiến hành kỹ thuật 2.1 Tách chiết DNA tổng số 2.2 Thực hiện Real-time PCR 2.3 Phân tích và đánh giá kết quả 2.4 In và trả kết quả 3. Thời gian thực hiện: 4 tiếng IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ Chứng dương phải xuất hiện đồ thị huỳnh quang trên đường giới hạn cơ bản, chứng âm không có bất kỳ đường đồ thị huỳnh quang nào xuất hiện. Đường đồ thị huỳnh quang của mẫu có thể xuất hiện hoặc không xuất hiện trên đường giới hạn cơ bản, căn cứ vào đó để kết luận kết quả. V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ - Trong trường hợp positive control (PC) và negative (NC) xuất hiện không đúng với diễn giải phần IV thì phải kiểm tra lại Master mix , chứng dương và quá trình tách DNA tổng số, và thực hiện lại toàn bộ xét nghiệm. - Nếu đường đồ thị huỳnh quang c a mẫu xuất hiện ngoài chu kỳ thứ 40 thì phải cẩn thận kiểm tra và đánh giá lại mẫu. Nguồn: Quyết định số: 6769/QĐ-BYT - Về việc ban hành tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh